Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de investigación de neurociencia y medicina oral tradicional sobre la detección de compuestos naturales neuroprotectores relevantes para el modelo. La principal ventaja de esta técnica es que la mayor producibilidad del volumen de infección está de acuerdo con la dosis de sincronización isquémica. La demostración visual de este método es crítica, ya que es típico insertar un implemento muy delgado en la arteria cerebelosa media original, utilizando un microscopio estéril.
Demostrar el procedimiento será Se-Eun Lee, un estudiante de primaria que estudia en mi laboratorio. Para preparar el extracto de Glycyrrhizae Radix et Rhizome, o GRex, primero agregue 200 gramos de Glycyrrhizae Radix et Rhizome, o GR, a dos litros de metanol para una incubación de cinco días a temperatura ambiente. Al final de la incubación, colar la solución a través de papel de filtro de 0,26 milímetros de espesor con un tamaño de poro de cinco micrómetros.
Agregue el residuo GR a un litro de metanol fresco y filtre la solución de nuevo. Combine los dos filtrados y colarlos a través de un nuevo pedazo de papel de filtro. A continuación, concentrar el extracto al vacío antes de secar por congelación para producir GRex.
Para preparar el GRex para su administración, disolver el producto liofilario en dimetilsulfóxido, y diluir la mezcla con 0,9% de solución salina fisiológica. A continuación, filtre la solución a través de un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros, y ajustar la concentración final de DMSO a menos de 5%Para configurar un modelo de oclusión de la arteria cerebral media del ratón, o MCAO, confirme una falta de respuesta al estímulo de cola en una manta de temperatura corporal anestesada de seis semanas de edad de 22 a 25 gramos macho C57BL/6, y coloque el ratón en una manta de temperatura corporal de 36,5 grados Celsius, conectada a un termómetro. Después de quitar todo el cabello del pecho y el cuello del ratón afeitando y depilatoriamente crema, coloque el ratón debajo de un estereomicroscopio y haga una incisión cutánea de dos centímetros en el centro del cuello.
Aísle cuidadosamente la arteria carótida común izquierda, la arteria carótida externa y la rama de la arteria carótida interna de los tejidos conectivos circundantes, y utilice una sutura de seda de 4.0 para ligar la arteria carótida externa y la arteria carótida común con un nudo de medio enganche para bloquear temporalmente el flujo sanguíneo hacia la arteria carótida interna. Inserte una sutura de 0,1 a 0,12 milímetros de espesor de 11 milímetros de largo recubierto de silicona de 8,0 monofilamento 4,0 a través de la arteria carótida interna hasta el origen de la arteria cerebral media izquierda, y utilice un medidor de flujo Doppler láser para medir la disminución de la arteria de flujo sanguíneo cerebral relativo. Fije el filamento insertado en el vaso sanguíneo durante dos horas mientras la arteria cerebral está ocluida.
Al final del período de oclusión, retire cuidadosamente el filamento para restaurar el flujo sanguíneo durante 22 horas de reperfusión. Y usa suturas de 3.0 de seda para suturar la piel en cinco lugares con dos nudos de medio enganche. A continuación, devuelva el ratón a su jaula para la recuperación anestésica.
Una hora después del final de la reperfusión, administrar 300 miligramos por kilogramo de peso corporal GRex a los animales experimentales, sólo por gavage oral. 24 Horas después del inicio de MCAO, haga una incisión en la piel media de la cabeza de cada animal experimental, y rompa los huesos parietales con fórceps en ángulo, mientras se despeja la dura mater. Aísle cuidadosamente el cerebro del cráneo y use una matriz cerebral de ratón para cortar el tejido extirpado en secciones gruesas de un milímetro.
Manche las secciones durante 17 minutos en una solución de 2%TTC, de acuerdo con los protocolos estándar. Y fije las secciones en 10% de formol durante al menos 2 horas antes de tomar imágenes de las muestras con una cámara digital. A continuación, analice y cuantifique el área de infarto cerebral de cada sección utilizando ImageJ.
En el punto de tiempo experimental apropiado después de la MCAO, perfume cada animal experimental eutanasiado transcardialmente con 10 mililitros de PBS, seguido de 10 mililitros de 4%paraformaldehído. Después de aislar los cerebros como se acaba de demostrar, sumerja los órganos cosechados en 10 mililitros de 30% de sacarosa durante la noche. A la mañana siguiente, incrustar las muestras de tejido cerebral en el compuesto de temperatura de corte óptima.
Y corta los tejidos coronalmente en secciones de 15 micrómetros de espesor sobre un cirostato. Montar las secciones en portaobjetos de vidrio y sumergir las secciones en 80%etanol durante 1 minuto. Para la tinción de H&E, etiquete las muestras con solución de Hematoxilina durante 5 minutos, seguida de dos caídas en alcohol ácido al 1%.
A continuación, sumerja los portaobjetos en una solución de carbonato de litio saturado durante 30 segundos, seguido de un lavado de 30 segundos en agua del grifo y 30 segundos de contramancha con solución de Eosin. Retire el exceso de solución de Eosin con un lavado con agua del grifo, y deshidrate los portaobjetos con inmersiones ascendentes de un minuto en 95 y luego 100%etanol. A continuación, airee los portaobjetos, despeje en xileno durante al menos 10 minutos y monte los cubreobjetos con el medio de montaje.
Para la tinción de color violeta cresil, coloque los portaobjetos tratados con 80% de etanol en un calentador de diapositivas durante al menos una hora, seguido de una inmersión en 50%etanol diluido con cloroformo durante la noche. A la mañana siguiente, tiñe los portaobjetos con 0,1% de crema violeta durante 10 minutos en un horno seco celsius de 40 grados, seguido de una deshidratación en 95% etanol durante 30 minutos, y dos inmersiones de cinco minutos al 100% de etanol. A continuación, despeje los portaobjetos dos inmersiones de xileno de cinco minutos, seguidos de secado al aire.
A continuación, monte las diapositivas con un medio de montaje para su visualización mediante microscopía de luz. En los grupos normales operados por sham, no se observa infarto cerebral;mientras que en control, los animales MCAO no tratados, se observa una gama relativamente amplia de áreas dañadas. En ratones modelo tratados con GRex de 300 miligramos por kilogramo, se observa una reducción estadísticamente significativa del tejido dañado.
El análisis histológico de las secciones de tejido teñido de violeta h&E y cresil proporciona un índice de supervivencia celular. De hecho, las intensidades de tinción de H&E y crema violeta disminuyen significativamente en el control, grupo MCAO no tratado en relación con el grupo normal operado por sham. Los animales tratados con GRex, por otro lado, exhiben una mayor integridad histológica, lo que implica menos muerte celular neuronal que los grupos de control, no tratados y operados por sham, lo que sugiere un potente efecto neuroprotector del extracto contra la lesión cerebral inducida por la reperfusión de isquemia.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar controlar el flujo sanguíneo cerebeloso relativo durante este período. Y los conductores de procesos con mucho cuidado para minimizar los daños a las capas endoteliales de la
