La sepsis puede provocar fallas multiorgánicos y la muerte. La endotoxina es un componente fundamental de las bacterias gramnegativas. Los niveles circulantes elevados de endotoxina podrían identificar al paciente con mayor riesgo de desarrollar una enfermedad más grave.
El ensayo de actividad de endotoxina se puede utilizar como un biomarcador simple, rápido y fiable de endoxemia sistémica. La detección temprana de esta toxina podría ayudar a los médicos a tratar a los pacientes con shock séptico. En pacientes con shock séptico, la identificación temprana de una afección en rápida evolución podría provocar una terapia de soporte vital más rápida e intensiva, lo que podría conducir a mejores resultados.
Demostrar este procedimiento estará Lisa Mathiasen, una bióloga molecular que colabora con nuestro grupo de investigación. Para comenzar este procedimiento, establezca un kit de prueba de EA y desempaquete los cinco tipos diferentes de tubos. Utilice el tubo número uno, el tubo de control, para medir la actividad basal de la ráfaga oxidativa no específica de los neutrófilos del paciente en ausencia de un anticuerpo específico.
Utilice el tubo número dos, el tubo de muestra, para medir la ráfaga oxidativa en respuesta al complejo lps-anticuerpo. Utilice el tubo número tres, el tubo Max, para medir la ráfaga oxidativa máxima de los neutrófilos del paciente en respuesta a un exceso de endotoxina. Utilice el tubo número cuatro, el tubo LPS, como fuente de endotoxina exógena.
Y usa el tubo número cinco, el tubo Aliquot, para el almacenamiento de sangre. Recoja muestras de sangre del paciente en tubos estériles que contengan anticoagulante EDTA y guárdelas a temperatura ambiente antes de realizar la prueba de EA. Antes de comenzar la prueba, encienda el quiciileuminómetro y la incubadora y caliente la incubadora a 37 grados centígrados.
En primer lugar, coloque los tubos de EA que se utilizarán en los portatubos y retire las tapas. Utilice una combipipette para transferir un mililitro del reactivo ea de la botella a los tubos número uno, número dos y número tres pipeteando por el lado de los tubos. Invierta suavemente el tubo de recolección de sangre 20 veces para mezclar la muestra de sangre del paciente.
Luego, pipeta 0,5 mililitros de sangre del paciente en el tubo número cuatro y tubo número cinco. Tubo vortex número cuatro durante 10 segundos. Coloque los portaequipajes con todos los tubos de ensayo de EA en la coctelera de incubadora.
Cierre la tapa e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de esto, abra la tapa de la incubadora y retire los portabrodas de la coctelera. Tubo de vórtice número cinco.
Usando una punta estéril, pipetear 40 microlitros de sangre en los tubos número uno y número dos, por duplicado. Tubo de vórtice número cuatro. Usando la misma punta de pipeta, transfiera 40 microlitros de sangre del tubo número cuatro al tubo número tres, por duplicado.
Vórtice los seis tubos de ensayo finales uno por uno. Vuelva a colocar los portaequipajes en la coctelera de incubación y cierre la tapa. Ajuste la coctelera a 100 rpm e inicie el movimiento durante 14 minutos.
Inserte la tarjeta de chip etiquetada por el asesor experto en el quimioiluminómetro y pulse Iniciar. Después de la incubación de 14 minutos, siga las instrucciones que aparecen en el quimiociómetro. Atratice suavemente cada tubo durante 10 segundos antes de colocarlo en el soporte de la muestra del quimioiluminómetro.
Abra el cajón de muestras y coloque el tubo número uno en el portavesero. A continuación, cierre el cajón de muestras y espere a que la unidad de luz relativa lea. Repita este proceso de lectura para los tubos dos y tres y todos los duplicados, como se describe en el protocolo de texto.
Una vez procesados todos los tubos, los resultados del EA se calcularán e imprimirán automáticamente. Repita el proceso de ensayo completo para cada muestra de sangre que dedá sea analizada. Almacene el kit de ensayo de EA y sus componentes en el embalaje sellado original a una temperatura de entre dos y 25 grados centígrados.
En este estudio, se realiza un ensayo de actividad de endotoxina para detectar endoxemia de sangre entera en pacientes en estado crítico. Un valor de EA inferior a 0,40 unidades EA indica un nivel bajo de actividad de endotoxina, igual a una concentración baja de LPS circulante, que representa un bajo riesgo de progresión a un estado grave de la enfermedad. Un resultado entre 0,40 y 0,59 unidades EA indica un nivel intermedio de actividad de endotoxina, que representa un riesgo intermedio para el desarrollo de sepsis grave y shock séptico.
Los resultados iguales o superiores a 0,60 unidades ea indican un nivel alto de actividad de endotoxinas, que representa un alto riesgo de shock séptico y resultados deficientes del paciente. La sangre de los tubos número cuatro y cinco debe mezclarse con el tubo de ensayo correcto. Se debe tener especial cuidado para seguir el orden correcto indicado en el protocolo.
Cada tubo se ejecuta en duplicados, lo que puede dar lugar a errores en esta fase. Después de su introducción, el ensayo EA ha sido propuesto como un biomarcador para la estratificación del riesgo del paciente con hipoperfusión sistémica. Además, se ha estudiado como una prueba de detección para seleccionar pacientes para estrategias avanzadas de tratamiento de hemopurificación.
