A sepse pode levar à falência e morte de vários órgãos. A endotoxina é um componente fundamental das bactérias gram-negativas. Níveis elevados de endotoxina podem identificar pacientes com maior risco para desenvolver uma doença mais grave.
O ensaio de atividade de endotoxina pode ser usado como um biomarcador simples, rápido e confiável de endotoxemia sistêmica. A detecção precoce dessa toxina pode ajudar os médicos a tratar pacientes com choque séptico. Em paciente com choque séptico, a identificação precoce de uma condição em rápida evolução pode levar a uma terapia de suporte de vida mais rápida e intensiva, potencialmente levando a melhores resultados.
Demonstrando esse procedimento estará Lisa Mathiasen, bióloga molecular que colabora com nosso grupo de pesquisa. Para iniciar este procedimento, defina um kit de teste EA e desempacotar os cinco tipos diferentes de tubos. Use o tubo número um, o tubo de controle, para medir a atividade basal da explosão oxidativa não específica dos neutrófilos do paciente na ausência de um anticorpo específico.
Use o tubo número dois, o tubo amostral, para medir a explosão oxidativa em resposta ao complexo de anticorpos LPS. Use o tubo número três, o tubo Max, para medir a explosão oxidativa máxima dos neutrófilos do paciente em resposta a um excesso de endotoxina. Use o tubo número quatro, o tubo LPS, como fonte de endotoxina exógena.
E use o tubo número cinco, o tubo de Aliquot, para armazenamento de sangue. Colete amostras de sangue do paciente em tubos estéreis contendo anticoagulantes EDTA e armazene-as à temperatura ambiente antes de executar o teste EA. Antes de iniciar o teste, ligue o quimiluminômetro e o shaker da incubadora e aqueça a incubadora a 37 graus Celsius.
Primeiro, coloque os tubos EA para serem usados em racks de tubo e remova as tampas. Use uma combipipette para transferir um mililitro do reagente EA da garrafa para os tubos número um, número dois e número três, pipetando para baixo na lateral dos tubos. Inverta suavemente o tubo de coleta de sangue 20 vezes para misturar a amostra de sangue do paciente.
Em seguida, pipeta 0,5 mililitros de sangue do paciente em tubo número quatro e tubo número cinco. Tubo vórtice número quatro por 10 segundos. Coloque os racks de tubo com todos os tubos de ensaio EA no agitador da incubadora.
Feche a tampa e incuba a 37 graus Celsius por 10 minutos. Depois disso, abra a tampa da incubadora e remova os racks do tubo do agitador. Tubo de vórtice número cinco.
Usando uma ponta estéril, pipeta 40 microliters de sangue em tubos número um e número dois, em duplicata. Tubo vórtice número quatro. Usando a mesma ponta de pipeta, transfira 40 microliters de sangue do tubo número quatro para o tubo número três, em duplicata.
Vórtice os seis tubos de teste finais um por um. Coloque os racks de tubo de volta no agitador de incubação e feche a tampa. Coloque o agitador a 100 rpm, e inicie o movimento por 14 minutos.
Insira o chipcard rotulado EA no quimiluminômetro e pressione Start. Após a incubação de 14 minutos, siga as instruções exibidas no chemiluminômetro. Vórtice suavemente cada tubo por 10 segundos antes de colocá-lo no suporte de amostra do chemiluminômetro.
Abra a gaveta de amostras e coloque o tubo número um no suporte da amostra. Em seguida, feche a gaveta de amostras e aguarde a leitura da unidade de luz relativa. Repita este processo de leitura para tubos dois e três e todas as duplicatas, conforme descrito no protocolo de texto.
Depois de todos os tubos terem sido processados, os resultados da EA serão calculados e impressos automaticamente. Repita todo o processo de ensaio para cada amostra de sangue que precisa ser testada. Armazene o kit de ensaio escrivão EA e seus componentes no pacote original lacrado a uma temperatura entre dois e 25 graus Celsius.
Neste estudo, um ensaio de atividade de endotoxina é realizado para detectar endototoximia sanguínea total em pacientes gravemente doentes. Um valor EA inferior a 0,40 unidades EA indica um baixo nível de atividade endotoxina, igual a uma baixa concentração de LPS circulante, o que representa um baixo risco de progressão para um estado grave da doença. Um resultado entre unidades de 0,40 e 0,59 EA indica um nível intermediário de atividade de endotoxina, o que representa um risco intermediário para o desenvolvimento de sepse grave e choque séptico.
Resultados iguais ou superiores a 0,60 unidades EA indicam um alto nível de atividade de endotoxina, o que representa um alto risco de choque séptico e desfechos ruins para os pacientes. O sangue dos tubos número quatro e cinco deve ser misturado com o tubo de ensaio correto. Deve-se tomar cuidado extra para seguir a ordem correta indicada no protocolo.
Todos os tubos são executados em duplicatas, potencialmente levando a erros nesta fase. Após sua introdução, o Ensaio EA foi proposto como biomarcador para a estratificação de risco do paciente com hipoperfusão sistêmica. Além disso, tem sido estudado como um teste de triagem para selecionar pacientes para estratégias avançadas de tratamento de hemopurificação.
