Presentamos un método para el análisis de imágenes en vivo de la absorción de colesterol LDL en varios tipos de células humanas. Esto permite detectar compuestos que modifican el transporte de colesterol LDL. La principal ventaja de utilizar imágenes de células vivas para la cuantificación de la afluencia de LDL, es que permite monitorear la morfología celular a lo largo de la duración del ensayo, por lo que potencialmente se pueden detectar los compuestos tóxicos.
Para empezar, aspirar los medios de las células previamente preparadas, y lavar las células con 5 mililitros de solución salina tamponada de Fosfato de Dulbecco. Aspirar el DPDS. A continuación, para separar las celdas de la placa de 100 milímetros, agregue 1,5 mililitros de 0,25%Trypsin-EDTA para las células HepG2, y agregue 1,5 mililitros de 0,05% de solución Trypsin-EDTA para las células HK2, o los HCAEC.
Incubar las placas a 37 grados centígrados durante cuatro minutos. Luego neutralice el Trypsin añadiendo 3 mililitros de medios completos para las células HepG2 y HCAEC. Utilice 3 mililitros de la solución neutralizante de Trippsina, comprometa el DPDS con un suero bovino 5%fetal o FBS para las células HK2.
Transfiera las células a tubos cónicos de 15 mililitros, luego centrifuga los tubos a 250 g durante cinco minutos. Después del giro, aspirar el medio, y resuspender el pellet celular en medios completos. Filtre las células de suspensión suavemente a través de un colador de malla de 40 micras para romper los grumos celulares.
Cuente las células y placúelas en una densidad optimizada en una placa de 24 pozos. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados para permitir que las células se adhieran. Al día siguiente, cambie el medio celular al medio base sin FBS para la línea celular, más 5%lipoproteína deficiente de suero, o 2%FBS medios.
Utilice 500 microlitros de medios totales por pozo en una placa de 24 pozos. Luego continúe la incubación durante 24 horas para morir de hambre a las células. Junto con el paso de hambre o al día siguiente, las células pueden ser tratadas con compuestos deseados y controles apropiados.
24 horas después de la inanición, añadir 5 microlitros de PHrodo de LDL con etiqueta roja a cada pozo que contenga 500 microlitros de medios para obtener una concentración final de 10 microgramos por mililitro. Retire con cuidado las burbujas de los pozos. Inmediatamente después de agregar el LDL etiquetado, coloque la placa en la incubadora del sistema de análisis celular vivo y permita que la placa se equilibre durante 15 minutos para reducir la condensación en la placa.
Mientras las células están incubando, abra el software y programe el escaneo agregando el recipiente que sostiene la placa. Imagen 16 imágenes por pozo, añadir intervalos de una hora a 10x aumento durante cuatro horas utilizando los canales rojo y de fase. A continuación, cree un mapa de placas para utilizarlo para el procesamiento de datos, seleccione la pestaña de propiedades y elija el mapa de placas.
Introduzca el tipo de celda en la pestaña de celdas y los tratamientos en el grifo compuesto. A continuación, haga clic en la pestaña Regiones, seleccione cada conjunto de réplicas y asigne regiones. Una vez completada una ejecución experimental, cree un conjunto de imágenes en el software para entrenar el equipo para cuantificar cada parámetro incluido en el conjunto de recuento.
En el software, abra la vista de placa y, a continuación, en el cuadro Utilidades de trabajo de análisis, elija crear o agregar a la colección de imágenes. Seleccione una nueva colección de imágenes, escriba un nombre para la colección de imágenes y elija los canales rojos y de fase marcando las casillas situadas junto a los canales. Seleccione cinco imágenes más de diferentes pozos y puntos de tiempo y agréguelas a la colección de imágenes agregando a la colección de imágenes actual.
En el cuadro Utilidades de trabajo de análisis, elija una nueva definición de procesamiento, seleccione la colección de imágenes en el menú desplegable y introduzca los parámetros para el tipo de celdas. En el cuadro de vista previa, utilice el menú desplegable para seleccionar la vista previa de todo. En el cuadro Máscara de análisis, active las casillas Máscara de confluencia y Máscara de objeto rojo para ver el área incluida en el análisis para la definición de procesamiento.
Desplácese por la colección de imágenes para asegurarse de que las celdas y LDL se incluyen en la máscara. Seleccione el archivo y guarde la definición de procesamiento. A continuación, abra la vista de placa de experimentación para analizar el conjunto de imágenes de la ejecución experimental.
En el cuadro Utilidades de trabajo de análisis, elija Iniciar nuevo trabajo de análisis y seleccione la definición de procesamiento guardada. Asigne un nombre al trabajo de análisis, elija el intervalo de tiempo para el análisis y resalte los pozos experimentales que desea analizar. Seleccione el botón de inicio.
Una vez completado el trabajo de análisis, exporte los datos, seleccione el análisis completado y pulse la vista. En el menú de utilidades, elija la exportación de gráficos de métricas. En el menú de regiones, elija todos los pozos y en el menú de grupo, para obtener el valor medio para cada conjunto de pozos como un grupo, elija réplicas.
Y para exportar los valores individuales para cada pozo, elija ninguno. En el menú de métricas de objetos rojos, elija la intensidad total integrada del objeto rojo. Seleccione el botón de exportación de datos.
Comprobar desglosar datos en imágenes individuales. Los datos se copian automáticamente en un portapapeles y se pueden pegar en un nuevo archivo de hoja de cálculo. En el menú de métricas de objeto de fase, elija la confluencia y, a continuación, haga clic en el botón de exportación de datos.
En la pestaña de solicitud, active Dividir datos en imágenes individuales. Los datos se copian automáticamente en un portapapeles y se pueden pegar en el archivo de hoja de cálculo que contiene datos de intensidad integrada de objetos rojos totales. Ahora los datos exportados se pueden normalizar, de acuerdo con los pasos 4.1.7 y 4.1.8 del protocolo, para obtener un valor de captación de LDL final.
Tras el tratamiento con Dynasore o PCSK9 recombinante, las tres líneas celulares humanas probadas mostraron reducciones significativas en la afluencia de LDL durante un período de tiempo de cuatro horas. La afluencia de LDL se reduce en el carcinoma hepático humano o en las células HepG2, con tratamiento de Dynasore durante el período de tiempo, en comparación con las células tratadas con DMSO como control. Las imágenes de células vivas de la afluencia de LDL en células HepG2 en diferentes puntos de tiempo mostraron un aumento del mercado en la absorción de LDL tras el tratamiento con Simvastatina, lo que apoyó la sensibilidad de este método para detectar alteraciones significativas en la afluencia de LDL.
Imágenes en tiempo real investigadas en el punto de tiempo inicial y punto final, confirman la morfología normal de las células después del tratamiento con Dynasore, indicando la eficacia y la seguridad de este compuesto. Después de agregar más LDL con etiqueta roja a las células para preservar su actividad fluorescente, es importante proteger la placa de la luz hasta que se coloque en la incubadora del sistema de imágenes de células vivas. Las células de diferentes órganos pueden responder de manera diferente a los tratamientos, es decir, en direcciones opuestas, o pueden responder en las mismas direcciones, pero muestran diferentes tasas de cambio en la absorción de colesterol.
Sólo con las imágenes de células vivas se pueden detectar y cuantificar con precisión tales diferencias.
