LDL 콜레스테롤 섭취량의 실시간 이미지 분석을 다양한 인간 세포 유형으로 제시하는 방법을 제시합니다. 이 화합물에 대 한 화면을 수 있습니다., 그 LDL 콜레스테롤의 전송을 수정. LDL 유입 정량화를 위해 라이브 세포 이미징을 사용하는 주요 장점은 분석 기간 전반에 걸쳐 세포 형태를 모니터링할 수 있으므로 잠재적으로 독성 화합물을 검출할 수 있다는 것입니다.
시작하려면, 이전에 준비 된 세포에서 미디어를 흡인하고, 덜벡코의 인산염 완충 식염수의 5 밀리리터로 세포를 씻어. DPDS를 흡인합니다. 100밀리미터 접시에서 세포를 분리하고 HepG2 셀에 대해 0.25%의 트립신-EDTA의 1.5 밀리리터를 추가하고 HK2 세포 또는 HCAEC에 대해 0.05%의 트립신-EDTA 용액을 1.5 밀리리터를 추가합니다.
접시를 섭씨 37도에서 4분간 배양합니다. 그런 다음 HepG2 및 HCAEC 셀에 대한 완전한 미디어의 3 밀리리터를 추가하여 트립신을 중화시합니다. 트립신 중화 용액의 3 밀리리터를 사용하여 HK2 세포에 대해 5 %의 태아 소 혈청 또는 FBS로 DPDS를 손상시십시오.
세포를 15밀리리터 원내 튜브로 옮긴 다음 5분 동안 250g의 튜브를 원심분리합니다. 스핀 후, 미디어를 흡인하고, 완전한 매체에서 셀 펠릿을 다시 놓습니다. 세포 현탁액을 40 미크론 메쉬 스트레이너를 통해 부드럽게 필터링하여 세포 덩어리를 분해합니다.
세포를 계산하고 24웰 플레이트에서 최적화된 밀도로 플레이트를 플레이트합니다. 세포가 부착할 수 있도록 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양합니다. 다음 날, 세포주에 대한 FBS없이 기본 매체로 세포 매체를 변경, 플러스 5 % 지단백질 결핍 혈청, 또는 2 % FBS 매체.
24웰 플레이트에 우물당 총 미디어 500마이크로리터를 사용하십시오. 그런 다음 세포를 굶어 24 시간 동안 인큐베이션을 계속하십시오. 기아 단계 또는 다음 날과 함께, 세포는 원하는 화합물 및 적절한 제어로 치료될 수 있다.
기아 후 24시간, 5마이크로리터의 pHrodo 적색 LDL을 각 웰에 추가하여 밀리리터당 10마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다. 조심스럽게 우물에서 거품을 제거합니다. 라벨이 부착된 LDL을 추가한 직후, 플레이트를 라이브 셀 분석 시스템 인큐베이터에 배치하고 플레이트의 응축을 줄이기 위해 15분 동안 플레이트를 평형화할 수 있도록 합니다.
세포가 배양하는 동안 소프트웨어를 열고 플레이트를 들고 있는 용기를 추가하여 스캔을 예약합니다. 이미지 16 이미지 당 이미지, 빨간색 및 위상 채널을 사용하여 4 시간 동안 10 배율에서 1 시간 간격을 추가합니다. 그런 다음 데이터 처리에 사용할 플레이트 맵을 만들고 속성 탭을 선택하고 플레이트 맵을 선택합니다.
셀 탭및 복합 탭에서 의 처리에 셀 유형을 입력합니다. 그런 다음 지역 탭을 클릭하고 각 복제 집합을 선택하고 지역을 할당합니다. 실험 실행이 완료되면 소프트웨어에 설정된 이미지를 만들어 컴퓨터가 계산 집합에 포함된 각 매개 변수를 정량화하도록 학습합니다.
소프트웨어에서 플레이트 뷰를 열고 분석 작업 유틸리티 상자에서 이미지 컬렉션 만들기 또는 추가를 선택합니다. 새 이미지 컬렉션을 선택하고 이미지 컬렉션의 이름을 입력하고 채널 옆의 상자를 선택하여 빨간색 및 위상 채널을 선택합니다. 서로 다른 우물과 시간 지점에서 5개의 이미지를 더 선택하고 현재 이미지 컬렉션에 추가하여 이미지 컬렉션에 추가합니다.
분석 작업 유틸리티 상자에서 새 처리 정의를 선택하고 드롭다운 메뉴에서 이미지 컬렉션을 선택하고 셀 유형에 대한 매개 변수를 입력합니다. 미리 보기 상자에서 드롭다운 메뉴를 사용하여 모든 미리 보기를 선택합니다. 분석 마스크 상자에서 인플루언스 마스크와 빨간색 오브젝트 마스크 박스를 선택하여 처리 정의에 대한 분석에 포함된 영역을 확인합니다.
이미지 컬렉션을 스크롤하여 셀과 LDL이 마스크에 포함되어 있는지 확인합니다. 파일을 선택하고 처리 정의를 저장합니다. 다음으로 실험 판 뷰를 열어 실험 실행에서 이미지 집합을 분석합니다.
분석 작업 유틸리티 상자에서 새 분석 작업을 시작하고 저장된 처리 정의를 선택합니다. 분석 작업의 이름을 지정하고, 분석시간 범위를 선택하고, 분석할 실험 우물을 강조 표시합니다. 시작 버튼을 선택합니다.
분석 작업이 완료되면 데이터를 내보내고 완료된 분석 및 프레스 보기를 선택합니다. 유틸리티 메뉴에서 메트릭 그래프 내보내기를 선택합니다. 지역 메뉴에서 모든 우물과 그룹 메뉴에서 각 우물 세트에 대한 평균 값을 그룹으로 선택하고 복제를 선택합니다.
그리고 각 음의 개별 값을 내보내면 선택하지 않습니다. 빨간색 개체 메트릭 메뉴에서 총 빨간색 개체 통합 강도를 선택합니다. 데이터 내보내기 단추를 선택합니다.
데이터를 개별 이미지로 분해하는지 확인합니다. 데이터는 클립보드에 자동으로 복사되며 새 스프레드시트 파일에 붙여갈 수 있습니다. 위상 개체 메트릭 메뉴에서 인플루언서를 선택한 다음 데이터 내보내기 단추를 클릭합니다.
프롬프트 탭에서 데이터를 개별 이미지로 분해한 지 확인합니다. 데이터는 클립보드에 자동으로 복사되며 총 빨간색 개체 통합 강도 데이터가 포함된 스프레드시트 파일에 붙여갈 수 있습니다. 이제 프로토콜의 4.1.7 단계 와 4.1.8 단계에 따라 내보낸 데이터를 정규화하여 최종 LDL uptake 값을 얻을 수 있습니다.
Dynasore 또는 재조합 PCSK9로 처리한 다음, 3개의 시험된 인간 세포주 모두는 4시간 과정 동안 LDL 유입에 있는 유의한 감소를 보여주었습니다. LDL 유입은 인간 간 암 종 또는 HepG2 세포에서 감소, 시간 과정 동안 Dynasore의 치료와 함께, 대조군으로 DMSO로 처리 된 세포에 비해. HepG2 세포에서 LDL 유입의 라이브 세포 이미징은 LDL 유입에 상당한 변화를 검출하는 이 방법의 감도를 지원하는 Simvastatin을 이용한 치료 후 LDL 섭취량의 시장 증가를 보여주었다.
초기 시점 및 최종 종점에서 조사된 실시간 이미지는 Dynasore 처리 후 세포의 정상적인 형태학을 확인하여 이 화합물의 효과와 안전성을 나타냅니다. 형광 활성을 보존하기 위해 세포에 추가 빨간색 표시 LDL을 추가 한 후, 살아있는 세포 이미징 시스템 인큐베이터에 배치 될 때까지 빛으로부터 플레이트를 보호하는 것이 중요합니다. 다른 기관에서 세포는 치료에 다르게 반응할 수 있습니다., 반대 방향으로 의미, 또는 그들은 같은 방향으로 응답 하지만 콜레스테롤 섭취에 변화의 다른 비율을 표시할 수 있습니다.
살아있는 세포 화상 진찰을 통해서만 그러한 차이를 검출하고 정확하게 정량화할 수 있습니다.
