אנו מציגים שיטה לניתוח תמונה חיה של ספיגת כולסטרול LDL לסוגי תאים אנושיים שונים. זה מאפשר לסנן עבור תרכובות, לשנות את ההובלה של כולסטרול LDL. היתרון העיקרי של שימוש בהדמיית תאים חיים לכימות זרם LDL, הוא שהוא מאפשר ניטור מורפולוגיה של התא לאורך כל תקופת ההתמדה, כך שניתן לזהות את התרכובות הרעילות.
כדי להתחיל, שאפו את התקשורת מהתאים שהוכנו בעבר, ושטפו את התאים ב-5 מיליליטר של תמיסת מלח פוספט של דולבקו. שאפו את ה-DPDS. לצד לנתק את התאים מהצלחת 100 מילימטר, להוסיף 1.5 מיליליטר של 0.25%Trypsin-EDTA עבור תאי HepG2, ולהוסיף 1.5 מיליליטר של 0.05%טריפסין-EDTA פתרון עבור תאי HK2, או HCAECs.
דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע דקות. לאחר מכן לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 3 מיליליטר של מדיה מלאה עבור התאים HepG2 ו HCAEC. השתמש 3 מיליליטר של פתרון נטרול טריפסין, לסכן את DPDS עם 5%נסיוב בקר עוברי או FBS עבור תאי HK2.
מעבירים את התאים לצינורות חרוטיים 15 מיליליטר, ואז צנטריפוגה הצינורות ב 250g במשך חמש דקות. לאחר הספין, שאף את התקשורת ולחץ מחדש על גלולת התא במדיה מלאה. סנן את התאים מתלים בעדינות דרך מסננת רשת של 40 מיקרון כדי לפרק גושי תאים.
לספור את התאים צלחת אותם בצפיפות אופטימיזציה בצלחת 24 באר. דגירה הצלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתאים לצרף. למחרת, שנה את מדיית התא למדיית הבסיס ללא FBS עבור קו התא, בתוספת סרום חסר ליפופרוטאין של 5%, או מדיה של 2%FBS.
השתמש 500 microliters של מדיה הכוללת לגם בצלחת 24 באר. ואז להמשיך את הדגירה במשך 24 שעות כדי להרעיב את התאים. יחד עם שלב הרעב או למחרת, תאים עשויים להיות מטופלים עם תרכובות רצויות פקדים מתאימים.
24 שעות לאחר רעב, להוסיף 5 microliters של pHrodo אדום שכותרתו LDL לכל באר המכילה 500 microliters של מדיה כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר. בזהירות להסיר את כל הבועות מן הבארים. מיד לאחר הוספת LDL שכותרתו, מניחים את הצלחת באינקובטור מערכת ניתוח תא חי ולאפשר את הצלחת לצייד במשך 15 דקות כדי להפחית את עיבוי בצלחת.
בזמן שהתאים דגירה, לפתוח את התוכנה ולתזמן את הסריקה על ידי הוספת כלי מחזיק את הצלחת. תמונה 16 תמונות ל הבאר, להוסיף מרווחי שעה אחת בהגדלה 10x במשך ארבע שעות באמצעות ערוצי אדום פאזה. לאחר מכן צרו מפת לוח לשימוש לעיבוד נתונים, בחרו בכרטיסיה 'מאפיינים' ובחרו במפת הלוח.
הזן את סוג התא בכרטיסיה ובטיפולים של התאים בהקשה המורכבת. לאחר מכן לחץ על הכרטיסיה אזורים, בחר כל קבוצה של שכפולים והקצה אזורים. לאחר השלמת ריצה ניסיונית, צור ערכת תמונות בתוכנה כדי לאמן את המחשב לכמת כל פרמטר הכלול בקבוצת הספירה.
בתוכנה, פתח את תצוגת הלוח, ולאחר מכן בתיבה כלי שירות של עבודת ניתוח, בחר צור או הוסף לאוסף התמונות. בחרו אוסף תמונות חדש, הקלו שם לאוסף התמונות ובחרו בערוצי האדום והפסים על-ידי סימון התיבות שלסמוך לערוצים. בחרו חמש תמונות נוספות מ בארות ונקודות זמן שונות והוסיפו אותן לאוסף התמונות על-ידי הוספה לאוסף התמונות הנוכחי.
בתיבה כלי שירות של פעולות ניתוח, בחר הגדרת עיבוד חדשה, בחר את אוסף התמונות מהתפריט הנפתח, הזן את הפרמטרים עבור סוג התאים. בתיבת התצוגה המקדימה, השתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור תצוגה מקדימה של הכל. בתיבה מסיכת ניתוח, סמן את מסיכת הקונפלונס ואת תיבות מסיכת האובייקט האדום כדי להציג את האזור הכלול בניתוח עבור הגדרת העיבוד.
גלול באוסף התמונות כדי להבטיח שהתאים וה- LDL ייכללו במסכה. בחר קובץ ושמור את הגדרת העיבוד. לאחר מכן, פתח את תצוגת לוח הניסוי כדי לנתח את ערכת התמונות מההפעלה הניסיונית.
בתיבה כלי שירות של משרות ניתוח, בחר הפעל עבודת ניתוח חדשה ובחר את הגדרת העיבוד השמורה. תן שם לעבודת הניתוח, בחר את טווח הזמן לניתוח והדגש את בארות הניסוי לניתוח. בחר בלחצן ההפעלה.
לאחר השלמת עבודת הניתוח, יצא את הנתונים, בחר את הניתוח שהושלם ולחץ על תצוגה. בתפריט כלי השירות, בחר ייצוא תרשים מטרי. בתפריט אזורים, בחר את כל בארות בתפריט הקבוצה, כדי לקבל את הערך הממוצע עבור כל קבוצה של בארות כקבוצה, בחר שכפולים.
ולייצוא הערכים הבודדים עבור כל באר, בחר אף אחד. בתפריט מטרי של אובייקט אדום, בחר בעוצמה המשולבת הכוללת של האובייקט האדום. בחר בלחצן ייצוא הנתונים.
בדוק את נתוני ההתפרקות לתמונות בודדות. הנתונים מועתקים באופן אוטומטי בלוח ונועברים לקובץ גיליון אלקטרוני חדש. בתפריט המדד של אובייקט הפאזה, בחר את ההתכנסות ולאחר מכן לחץ על לחצן ייצוא הנתונים.
בכרטיסיה בקשה, סמן את אורך הנתונים בתמונות בודדות. הנתונים מועתקים באופן אוטומטי בלוח ונוכלים להיות מודבקים בקובץ הגיליון האלקטרוני המכיל נתוני עוצמה משולבים כוללים של אובייקט אדום. כעת ניתן לנרמל את הנתונים המיוצאים, בהתאם לצעדים 4.1.7 ו- 4.1.8 של הפרוטוקול, כדי להשיג ערכי ספיגת LDL סופיים.
לאחר טיפול עם Dynasore או PCSK9 רקומביננטי, כל שלושת קווי התא האנושי נבדק הראו הפחתה משמעותית זרם LDL על פני קורס זמן של ארבע שעות. זרמי LDL מופחת קרצינומה של הכבד האנושי או תאי HepG2, עם טיפול של Dynasore לאורך זמן כמובן, לעומת התאים שטופלו DMSO כפקד. הדמיית תאים חיים של זרם LDL בתאי HepG2 בנקודות זמן שונות הראתה עלייה בשוק ספיגת LDL בעקבות טיפול עם Simvastatin התומך ברגישות של שיטה זו כדי לזהות שינויים משמעותיים בזרם LDL.
תמונות בזמן אמת שנחקרו בנקודת הזמן הראשונית ובנקודת הסיום הסופית, מאשרות את המורפולוגיה הרגילה של התאים לאחר הטיפול בדינאסור, מה שמצביע על היעילות והבטיחות של תרכובת זו. לאחר הוספת LDL אדום נוסף לתאים כדי לשמר את פעילותו הפלואורסצנטית, חשוב להגן על הצלחת מפני אור עד שהיא ממוקמת באינקובטור מערכת ההדמיה של התא החי. תאים מאיברים שונים יכולים להגיב באופן שונה לטיפולים, כלומר בכיוונים מנוגדים, או שהם עשויים להגיב באותם כיוונים אך מראים שיעורים שונים של שינוי בקליטת הכולסטרול.
רק עם הדמיית התא החי ניתן לזהות הבדלים כאלה ולמתת במדויק.
