Nous présentons une méthode pour l’analyse d’image vivante de l’absorption de cholestérol de LDL dans divers types humains de cellules. Cela permet de dépister les composés, qui modifient le transport du cholestérol LDL. Le principal avantage de l’utilisation de l’imagerie cellulaire vivante pour la quantification de l’afflux de LDL, c’est qu’elle permet de surveiller la morphologie cellulaire tout au long de la durée de l’analyse, de sorte que potentiellement les composés toxiques peuvent être détectés.
Pour commencer, aspirez les médias des cellules précédemment préparées, et lavez les cellules avec 5 millilitres de saline tamponnée de phosphate de Dulbecco. Aspirez le DPDS. À côté de détacher les cellules du plat de 100 millimètres, ajouter 1,5 millilitres de 0,25%Trypsine-EDTA pour les cellules HepG2, et ajouter 1,5 millilitres de 0,05%Trypsine-EDTA solution pour les cellules HK2, ou les HCAECs.
Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant quatre minutes. Neutralisez ensuite la trypsine en ajoutant 3 millilitres de supports complets pour les cellules HepG2 et HCAEC. Utilisez 3 millilitres de la solution neutralisante trypsine, compromettre le DPDS avec 5% sérum bovin fœtal ou FBS pour les cellules HK2.
Transférer les cellules dans des tubes coniques de 15 millilitres, puis centrifuger les tubes à 250g pendant cinq minutes. Après le spin, aspirer les médias, et résusquer la pastille cellulaire dans les médias complets. Filtrer délicatement la suspension des cellules à travers une passoire en maille de 40 microns pour briser les touffes cellulaires.
Comptez les cellules et plaquez-les dans une densité optimisée dans une plaque de 24 puits. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius pour permettre aux cellules de se fixer. Le lendemain, changer les médias cellulaires pour les médias de base sans FBS pour la ligne cellulaire, plus 5% de sérum déficient en lipoprotéine, ou 2%FBS médias.
Utilisez 500 microlitres de supports totaux par puits dans une assiette de 24 puits. Ensuite, continuer l’incubation pendant 24 heures pour affamer les cellules. Avec l’étape de famine ou le jour suivant, les cellules peuvent être traitées avec les composés désirés et les contrôles appropriés.
24 heures après la famine, ajouter 5 microlitres de LDL rouge pHrodo étiquetés à chaque puits contenant 500 microlitres de médias pour obtenir une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre. Retirez soigneusement les bulles des puits. Immédiatement après l’ajout du LDL étiqueté, placez la plaque dans l’incubateur du système d’analyse cellulaire vivante et laissez la plaque s’équilibrer pendant 15 minutes pour réduire la condensation dans la plaque.
Pendant que les cellules couvent, ouvrez le logiciel et planifiez l’analyse en ajoutant le récipient tenant la plaque. Image 16 images par puits, ajouter des intervalles d’une heure à 10x grossissement pendant quatre heures en utilisant les canaux rouges et de phase. Créez ensuite une carte des plaques à utiliser pour le traitement des données, sélectionnez l’onglet propriétés et choisissez la carte des plaques.
Entrez le type de cellule dans l’onglet cellules et les traitements dans le robinet composé. Cliquez ensuite sur l’onglet régions, sélectionnez chaque ensemble de répliques et assignez des régions. Une fois qu’une course expérimentale est terminée, créez une image définie dans le logiciel pour former l’ordinateur à quantifier chaque paramètre inclus dans l’ensemble de comptage.
Dans le logiciel, ouvrez la vue plaque, puis dans la boîte d’analyse des utilitaires de travail, choisissez de créer ou d’ajouter à la collection d’images. Sélectionnez la nouvelle collection d’images, tapez un nom pour la collection d’images et choisissez les canaux rouges et de phase en cochant les cases à côté des canaux. Sélectionnez cinq autres images à partir de différents puits et points de temps et ajoutez-les à la collection d’images en ajoutant à la collection d’images actuelle.
Dans la boîte d’analyse des services publics d’emploi, choisissez une nouvelle définition de traitement, sélectionnez la collection d’images dans le menu drop-down, entrez les paramètres pour le type de cellules. Dans la boîte d’aperçu, utilisez le menu drop-down pour sélectionner l’aperçu de tous. Dans la boîte de masque d’analyse, cochez le masque de confluence et les boîtes de masque d’objet rouge pour afficher la zone incluse dans l’analyse de la définition de traitement.
Faites défiler la collection d’images pour vous assurer que les cellules et le LDL sont inclus dans le masque. Sélectionnez le fichier et enregistrez la définition de traitement. Ensuite, ouvrez la vue de plaque d’expérimentation pour analyser l’ensemble des images de la course expérimentale.
Dans la boîte de services publics d’analyse, choisissez de lancer un nouvel emploi d’analyse et sélectionnez la définition de traitement enregistrée. Nommez le travail d’analyse, choisissez la plage de temps pour l’analyse et mettez en évidence les puits expérimentaux à analyser. Sélectionnez le bouton de lancement.
Une fois le travail d’analyse terminé, exportez les données, sélectionnez l’analyse terminée et la vue presse. Dans le menu des services publics, choisissez l’exportation graphique métrique. Dans le menu régions, choisissez tous les puits et dans le menu de groupe, pour obtenir la valeur moyenne pour chaque ensemble de puits en tant que groupe, choisissez des répliques.
Et pour exporter les valeurs individuelles pour chaque puits, ne choisissez aucune. Dans le menu métrique objet rouge, choisissez l’intensité intégrée totale de l’objet rouge. Sélectionnez le bouton d’exportation de données.
Vérifiez décomposer les données en images individuelles. Les données sont automatiquement copiées sur un presse-papiers et peuvent être passées à un nouveau fichier de feuille de calcul. Dans le menu métrique de l’objet de phase, choisissez la confluence, puis cliquez sur le bouton d’exportation de données.
Dans l’onglet invite, vérifiez décomposer les données en images individuelles. Les données sont automatiquement copiées sur un presse-papiers et peuvent être passées au fichier de feuille de calcul contenant des données d’intensité intégrées à l’objet rouge total. Maintenant, les données exportées peuvent être normalisées, selon les étapes 4.1.7 et 4.1.8 du protocole, pour obtenir une valeur finale d’absorption de LDL.
Après traitement par Dynasore ou PCSK9 recombinant, les trois lignées cellulaires humaines testées ont montré des réductions significatives de l’afflux de LDL sur un cours de quatre heures. Les afflux de LDL réduits dans le carcinome hépatique humain ou les cellules d’HepG2, avec le traitement de Dynasore au cours du temps, comparé aux cellules traitées avec DMSO comme contrôle. L’imagerie cellulaire vivante de l’afflux de LDL dans les cellules HepG2 à différents moments a montré une augmentation du marché de l’absorption de LDL après traitement avec Simvastatin soutenant la sensibilité de cette méthode pour détecter des changements significatifs dans l’afflux de LDL.
Les images en temps réel étudiées au point de temps initial et au point final, confirment la morphologie normale des cellules suivant le traitement de Dynasore, indiquant l’efficacité et l’innocuité de ce composé. Après avoir ajouté d’autres LDL étiquetés rouges aux cellules pour préserver son activité fluorescente, il est important de protéger la plaque de la lumière jusqu’à ce qu’elle soit placée dans l’incubateur du système d’imagerie cellulaire vivante. Les cellules de différents organes peuvent réagir différemment aux traitements, c’est-à-dire dans des directions opposées, ou elles peuvent réagir dans les mêmes directions, mais présentent des taux différents de changement dans l’absorption du cholestérol.
Ce n’est qu’avec l’imagerie cellulaire vivante que de telles différences peuvent être détectées et quantifiées avec précision.
