Wir präsentieren eine Methode zur Live-Bildanalyse der LDL-Cholesterinaufnahme in verschiedenen menschlichen Zelltypen. Dies ermöglicht es, auf Verbindungen zu überprüfen, die den Transport von LDL-Cholesterin modifizieren. Der Hauptvorteil der Verwendung von Live-Zell-Bildgebung für Die LDL-Influxquantifizierung ist, dass es die Überwachung der Zellmorphologie während der gesamten Assay-Dauer ermöglicht, so dass potenziell die toxischen Verbindungen nachgewiesen werden können.
Zunächst sollten Sie die Medien von den zuvor vorbereiteten Zellen absaugen und die Zellen mit 5 Millilitern der phosphatgepufferten Saline von Dulbecco waschen. Aspirieren Sie die DPDS. Fügen Sie neben dem Lösen der Zellen von der 100-Millimeter-Schale 1,5 Milliliter 0,25%Trypsin-EDTA für die HepG2-Zellen hinzu und fügen Sie 1,5 Milliliter 0,05%Trypsin-EDTA-Lösung für die HK2-Zellen oder die HCAECs hinzu.
Die Platten vier Minuten lang bei 37 Grad Celsius bebrüten. Dann neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie 3 Milliliter komplette Medien für die HepG2- und HCAEC-Zellen hinzufügen. Verwenden Sie 3 Milliliter der Trypsin-Neutralisierungslösung, kompromittieren Sie die DPDS mit 5% fetalem Rinderserum oder FBS für die HK2-Zellen.
Übertragen Sie die Zellen in 15 Milliliter konische Röhren, dann zentrifugieren Sie die Rohre bei 250g für fünf Minuten. Nach dem Drehen die Medien ansaugen und das Zellpellet in vollständigen Medien wieder aussetzen. Filtern Sie die Zellsuspension sanft durch ein 40-Mikron-Netzsieb, um Zellklumpen aufzubrechen.
Zählen Sie die Zellen und verdichten Sie sie in einer optimierten Dichte in einer 24-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius, damit sich die Zellen anbringen können. Ändern Sie am nächsten Tag das Zellmedium in das Basismedium ohne FBS für die Zelllinie, plus 5% Lipoprotein-Mangelserum oder 2%FBS-Medien.
Verwenden Sie 500 Mikroliter Gesamtmedien pro Brunnen in einer 24-Well-Platte. Dann setzen Sie die Inkubation für 24 Stunden fort, um die Zellen auszuhungern. Zusammen mit dem Hungerschritt oder dem folgenden Tag können Zellen mit gewünschten Verbindungen und geeigneten Kontrollen behandelt werden.
24 Stunden nach dem Hungertod 5 Mikroliter pHrodo rot mit LDL beschriftet zu jedem Brunnen mit 500 Mikroliter Medien hinzufügen, um eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Entfernen Sie vorsichtig alle Blasen aus den Brunnen. Legen Sie die Platte unmittelbar nach dem Hinzufügen der beschrifteten LDL in den Inkubator des Live-Zellanalysesystems und lassen Sie die Platte 15 Minuten lang ausdemalibrisieren, um die Kondensation in der Platte zu reduzieren.
Während die Zellen inkubieren, öffnen Sie die Software und planen Sie den Scan, indem Sie das Gefäß hinzufügen, das die Platte hält. Bild 16 Bilder pro Brunnen, fügen Sie eine Stunde Intervalle bei 10x Vergrößerung für vier Stunden mit dem roten und Phasenkanäle. Erstellen Sie dann eine Plattenkarte, die für die Datenverarbeitung verwendet werden soll, wählen Sie die Registerkarte Eigenschaften aus und wählen Sie die Plattenzuordnung aus.
Geben Sie den Zelltyp in die Registerkarte Zellen und die Behandlungen im zusammengesetzten Tippen ein. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Regionen, wählen Sie jeden Satz von Replikationen aus und weisen Sie Regionen zu. Sobald ein experimenteller Lauf abgeschlossen ist, erstellen Sie einen Imagesatz in der Software, um den Computer zu trainieren, um jeden Parameter zu quantifizieren, der im Zählsatz enthalten ist.
Öffnen Sie in der Software die Plattenansicht, und wählen Sie dann im Feld Analyseauftragsdienstprogramme Erstellen oder Hinzufügen zur Bildsammlung aus. Wählen Sie eine neue Bildsammlung aus, geben Sie einen Namen für die Bildsammlung ein, und wählen Sie die roten Kanäle und Die Phasenkanäle aus, indem Sie die Kontrollkästchen neben den Kanälen aktivieren. Wählen Sie fünf weitere Bilder aus verschiedenen Brunnen und Zeitpunkten aus, und fügen Sie sie der Bildsammlung hinzu, indem Sie sie der aktuellen Bildsammlung hinzufügen.
Wählen Sie im Feld Analyseauftragsdienstprogramme eine neue Verarbeitungsdefinition aus, wählen Sie die Bildsammlung aus dem Dropdownmenü aus, geben Sie die Parameter für den Zellentyp ein. Verwenden Sie im Vorschaufeld das Dropdown-Menü, um alle Vorschau anzuzeigen. Aktivieren Sie im Feld Analysemaske die Einmündungsmaske und die felder roten Objektmasken, um den Bereich anzuzeigen, der in der Analyse für die Verarbeitungsdefinition enthalten ist.
Führen Sie einen Bildlauf durch die Bildsammlung durch, um sicherzustellen, dass die Zellen und LDL in der Maske enthalten sind. Wählen Sie Datei aus, und speichern Sie die Verarbeitungsdefinition. Öffnen Sie anschließend die Experimentierplattenansicht, um den Satz von Bildern aus dem Versuchslauf zu analysieren.
Wählen Sie im Feld Analyseauftragsdienstprogramme neue Analyseauftrag starten aus, und wählen Sie die gespeicherte Verarbeitungsdefinition aus. Benennen Sie den Analyseauftrag, wählen Sie den Zeitbereich für die Analyse aus, und markieren Sie die zu analysierenden experimentellen Bohrungen. Wählen Sie die Starttaste aus.
Nachdem der Analyseauftrag abgeschlossen ist, exportieren Sie die Daten, wählen Sie die abgeschlossene Analyse und die Presseansicht aus. Wählen Sie im Menü Dienstprogramme den Metrikdiagrammexport aus. Wählen Sie im Menü "Regionen" alle Brunnen aus, und wählen Sie im Gruppenmenü die Replikationen aus, um den Mittelwert für jeden Satz von Bohrungen als Gruppe zu erhalten.
Und für den Export der einzelnen Werte für jeden Brunnen, wählen Sie keine. Wählen Sie im Menü rote Objektmetrik die integrierte Gesamtintensität des roten Objekts aus. Wählen Sie die Schaltfläche Datenexport aus.
Überprüfen Sie die Daten in einzelne Bilder aufteilen. Die Daten werden automatisch in eine Zwischenablage kopiert und können in eine neue Tabellenkalkulationsdatei eingefügt werden. Wählen Sie im Menü Phasenobjektmetrik die Konfluence aus, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Datenexport.
Überprüfen Sie auf der Registerkarte Eingabeaufforderung, um Daten in einzelne Bilder aufzuteilen. Die Daten werden automatisch in eine Zwischenablage kopiert und können in die Tabellenkalkulationsdatei eingefügt werden, die integrierte Intensitätsdaten für rote Objekte enthält. Nun können die exportierten Daten gemäß den Schritten 4.1.7 und 4.1.8 des Protokolls normalisiert werden, um endgültige LDL-Aufnahmewerte zu erhalten.
Nach der Behandlung mit Dynasore oder rekombinantem PCSK9 zeigten alle drei getesteten menschlichen Zelllinien signifikante Reduktionen des LDL-Zuflusses über einen vierstündigen Zeitverlauf. Die LDL-Zuflüsse reduzierten sich bei humanem Leberkarzinom oder HepG2-Zellen, mit Derbehandlung von Dynasore im Laufe des Zeitverlaufs, im Vergleich zu den Zellen, die mit DMSO als Kontrolle behandelt wurden. Die Live-Zell-Bildgebung des LDL-Zuflusses in HepG2-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten zeigte eine Marktzunahme der LDL-Aufnahme nach der Behandlung mit Simvastatin, die die Empfindlichkeit dieser Methode unterstützt, um signifikante Veränderungen im LDL-Zustrom zu erkennen.
Echtzeit-Bilder, die am Anfangs- und Endpunkt untersucht wurden, bestätigen die normale Morphologie der Zellen nach dynasore-Behandlung, was auf die Wirksamkeit und Die Sicherheit dieser Verbindung hinweist. Nach dem Hinzufügen weiterer rot beschrifteter LDL zu den Zellen, um seine fluoreszierende Aktivität zu erhalten, ist es wichtig, die Platte vor Licht zu schützen, bis sie in den Inkubator des Live-Zell-Bildgebungssystems gelegt wird. Zellen aus verschiedenen Organen können unterschiedlich auf Behandlungen reagieren, d. h. in entgegengesetzte Richtungen, oder sie können in die gleiche Richtung reagieren, aber unterschiedliche Veränderungsraten in der Cholesterinaufnahme aufweisen.
Nur mit der Live-Zell-Bildgebung können solche Unterschiede erkannt und genau quantifiziert werden.
