Мы представляем метод живого анализа изображения поглощения холестерина ЛПНП в различных типах клеток человека. Это позволяет проверять на соединения, которые изменяют транспортировку холестерина ЛПНП. Основным преимуществом использования живой клеточной визуализации для количественной оценки притока ЛПНП является то, что она позволяет контролировать морфологию клеток на протяжении всей продолжительности анализа, поэтому потенциально токсичные соединения могут быть обнаружены.
Для начала, аспирировать средства массовой информации от ранее подготовленных клеток, и мыть клетки с 5 миллилитров фосфата Dulbecco буфера солевого раствора. Аспирировать DPDS. Далее, чтобы отделить клетки от 100-миллиметровой тарелки, добавьте 1,5 миллилитров 0,25%трипсина-ЭДТА для клеток HepG2 и добавьте 1,5 миллилитров 0,05%трипсина-ЭДТА для ячеек HK2 или HCAECs.
Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в течение четырех минут. Затем нейтрализуем трипсин, добавив 3 миллилитров полных средств массовой информации для клеток HepG2 и HCAEC. Используйте 3 миллилитров трипсина нейтрализуя раствор, компромисс DPDS с 5%fetal бычьей сыворотки или FBS для клеток HK2.
Перенесите клетки в 15 миллилитровых конических труб, затем центрифуга труб при 250г в течение пяти минут. После спина, аспирировать средства массовой информации, и повторного перерасхода ячейки гранулы в полном средствах массовой информации. Фильтр клетки подвески мягко через 40 микрон сетки ситечко, чтобы разбить ячейки сгустки.
Подсчитайте клетки и пластины их в оптимизированной плотности в 24-хорошо пластины. Инкубировать пластину на ночь при 37 градусах по Цельсию, чтобы клетки прикрепляются. На следующий день, изменить сотовые средства массовой информации на базовые средства массовой информации без FBS для клеточной линии, плюс 5%липопротеинов недостаточно сыворотки, или 2%FBS средств массовой информации.
Используйте 500 микролитров общего объема средств массовой информации на колодец в 24-хорошо пластины. Затем продолжайте инкубацию в течение 24 часов, чтобы голодать клетки. Наряду с голоду шаг или на следующий день, клетки могут рассматриваться с желаемыми соединениями и соответствующие элементы управления.
Через 24 часа после голода, добавить 5 микролитров pHrodo красный помечены ЛПНП в каждой хорошо, содержащей 500 микролитров средств массовой информации, чтобы получить окончательную концентрацию 10 микрограмм на миллилитр. Аккуратно удалите пузырьки из колодцев. Сразу же после добавления помечены ЛПНП, поместите пластину в инкубатор системы анализа живых клеток и дайте пластине равноденствия в течение 15 минут, чтобы уменьшить конденсации в пластине.
В то время как клетки инкубируются, откройте программное обеспечение и запланируете сканирование, добавив сосуд, держащий пластину. Изображение 16 изображений на колодец, добавить один час интервалов в 10 раз увеличение в течение четырех часов с помощью красных и фазных каналов. Затем создайте карту пластин для обработки данных, выберите вкладку свойств и выберите карту пластины.
Вввеку типа клетки в вкладку клеток и процедуры в составе крана. Затем нажмите на вкладку регионов, выберите каждый набор репликаций и назначьте регионы. После завершения экспериментального запуска создайте набор изображений в программном обеспечении для обучения компьютера количественной оценке каждого параметра, включенного в набор подсчета голосов.
В программном обеспечении откройте представление пластины, затем в поле для работы анализа утилиты, выберите создать или добавить в коллекцию изображений. Выберите новую коллекцию изображений, ввемите имя для коллекции изображений и выберите красные и фазовые каналы, проверив коробки рядом с каналами. Выберите еще пять изображений из разных колодцев и точек времени и добавьте их в коллекцию изображений, добавив к текущей коллекции изображений.
В поле утилиты для анализа рабочих мест выберите новое определение обработки, выберите коллекцию изображений из выпадают из меню, вести параметры типа ячеек. В поле предварительного просмотра используйте меню высадки, чтобы выбрать предварительный просмотр всех. В поле маски анализа проверьте маску слияния и красные ящики для маски объекта, чтобы просмотреть область, включенную в анализ для определения обработки.
Прокрутите коллекцию изображений, чтобы обеспечить включение ячеек и ЛПНП в маску. Выберите файл и сохраните определение обработки. Затем откройте экспериментальное представление пластины для анализа набора изображений из экспериментального запуска.
В поле утилиты для анализа рабочих мест выберите новое задание анализа и выберите сохраненное определение обработки. Назовите задание по анализу, выберите диапазон времени для анализа и выделите экспериментальные скважины для анализа. Выберите кнопку запуска.
Как только задание по анализу завершено, экспорт данных, выберите завершенный анализ и просмотр прессы. В меню утилит выберите экспорт метрики графика. В меню регионов выбирайте все колодцы и в групповом меню, чтобы получить среднее значение для каждого набора скважин в группе, выбирайте репликации.
А для экспорта индивидуальных ценностей для каждого колодец, не выбирайте ни одного. В меню метрики красных объектов выберите общую интенсивность интегрированного красного объекта. Выберите кнопку экспорта данных.
Проверьте разбить данные на отдельные изображения. Данные автоматически копируются на буфер обмена и могут быть вкосяты в новый файл электронной таблицы. В меню метрики объектов фазы выберите слияние, а затем нажмите кнопку экспорта данных.
В оперативной вкладке проверьте разбиваем данные на отдельные изображения. Данные автоматически копируются на буфер обмена и могут быть втыкнулись в файл электронной таблицы, содержащий общие данные интегрированной интенсивности красных объектов. Теперь экспортируемые данные могут быть нормализованы, согласно шагам 4.1.7 и 4.1.8 протокола, для получения окончательных значений поглощения ЛПНП.
После лечения с Dynasore или рекомбинантных PCSK9, все три проверенных человеческих клеточных линий показали значительное сокращение притока ЛПНП в течение четырех часов времени курса. Приток ЛПНП сократился в человеческих печеночным карцинома или HepG2 клеток, с лечением династии с течением времени, по сравнению с клетками, обработанными DMSO в качестве контроля. Live клеточной визуализации притока ЛПНП в клетках HepG2 в разное время точки показали увеличение рынка поглощения ЛПНП после лечения симвастатином поддержки чувствительности этого метода для обнаружения значительных изменений в притоке ЛПНП.
Изображения в режиме реального времени, исследованные в начальной точке времени и конечной конечной точке, подтверждают нормальную морфологию клеток после лечения династии, что указывает на эффективность и безопасность этого соединения. После добавления дополнительных красных помечены ЛПНП в клетки, чтобы сохранить его флуоресцентной деятельности, важно, чтобы защитить пластину от света, пока он не помещен в инкубатор системы визуализации живых клеток. Клетки из разных органов могут по-разному реагировать на лечение, то есть в противоположных направлениях, или они могут реагировать в тех же направлениях, но показывают различные темпы изменения уровня поглощения холестерина.
Только с живой визуализации клеток такие различия могут быть обнаружены и точно количественно.
