Este método facilita la administración intratecal eficiente de transgenes virales adeno asociadas en animales pequeños despiertos para el tratamiento experimental de enfermedades del sistema nervioso central como la ELA. La principal ventaja de este método es que la solución viral incluye 1%clorhidrato de lidocaína que induce una parálisis transitoria después de una inyección exitosa. Aunque este método proporciona un indicador visual para juzgar el éxito de la situación automatizada intratecal, la práctica suficiente es esencial para mejorar la tasa de éxito de la entrega.
Antes de comenzar el procedimiento, coloque una aguja de calibre 27 en una jeringa Hamilton de 25 microlitrotros y alinee la punta biselada de la aguja con la escala volumétrica de la jeringa. A continuación, cargue cuidadosamente 8 microlitros de 4 x 10 a las copias del genoma 10 de la solución del virus en la jeringa, teniendo cuidado de evitar burbujas. A continuación, coloque un ratón despierto de 30 a 70 días de edad de 12 a 30 gramos sobre una pieza de cama en la posición propensa en una capucha de bioseguridad y cubra la parte superior del cuerpo con gasa estéril para calmar al ratón y evitar ser mordido.
Agarre firmemente el ratón sobre su faja pélvica con el pulgar en un lado y el dedo índice y medio en el otro lado manteniendo la piel entre las fajas pélvicas bilaterales tensas con un pulgar y un dedo índice. A continuación, afeitar el pelaje entre las fajas pélvicas bilaterales y esterilizar la piel expuesta con un exfoliante a base de yodo y 70%etanol. Para la administración intratecal directa de la solución vírica asociada al adeno, palpar el espacio intervertebral a lo largo de la línea media entre las fajas pélvicas bilaterales y utilizar una uña para deprimir una sangría en la piel para indicar el espacio intervertebral L5 a L6.
Gire la base de la cola ligeramente y suavemente para revelar la línea media de la columna vertebral y ajustar el bisel de la aguja hacia la cabeza del animal. Con el ratón firmemente fijado en su posición, alinee la aguja a lo largo de la línea media de la columna vertebral e inserte la aguja suavemente y verticalmente en el centro de la sangría manteniendo la jeringa en un plano sagital central. Cuando la aguja entra en contacto con el hueso, disminuya lentamente el ángulo a aproximadamente 30 grados y deslice la aguja en el espacio intervertebral.
Un movimiento de cola repentino es un signo de una entrada exitosa en el espacio intradural. Cuando la aguja entra en el espacio intervertebral, la punta se sentirá firmemente sujeta. Inyecte la solución vectorial y mantenga la aguja dentro del espacio intradural durante un minuto.
A continuación, retire lentamente la aguja con rotación para minimizar las fugas. Puntuar inmediatamente la debilidad transitoria de las extremidades del ratón para evaluar la calidad de la inyección y devolver el ratón a su jaula para su recuperación de la parálisis. En el punto final experimental adecuado, fije las extremidades y la cabeza del ratón inyectado en la posición propensa en una cubierta de la caja de espuma y use tijeras para quitar y quitar la piel de la cabeza al sacro.
Recorta el cráneo entre los ojos, corta a lo largo de la línea media del cráneo y la línea horizontal por encima del cerebelo y abre el cráneo a cada lado. Use pinzas para extraer el hueso occipital y use tijeras oftálmicas para abrir el canal espinal bilateralmente. Corte las costillas de ambos lados y retire cuidadosamente la sección superior de las vértebras.
Usa pinzas curvas para levantar el cerebro y cortar los nervios de la base del cráneo. Luego extrae cuidadosamente todo el cerebro y la médula espinal y fija los tejidos en 4%paraformaldehído durante 24 horas. Al final del período de fijación, crioprotece el cerebro y la médula espinal cervical y lumbar en una solución de 30% de sacarosa durante la noche a 4 grados centígrados seguido de la incrustación en un compuesto óptimo de temperatura de corte antes de congelar el nitrógeno líquido.
A continuación, utilice un criostato para obtener secciones de 25 micrómetros de espesor de cada tejido, almacenando las secciones congeladas en 0,01 PBS molar a 4 grados centígrados a medida que se obtienen. Para el análisis inmunohistoquímico de los tejidos, pretrata las secciones flotantes libres con 1%peróxido de hidrógeno durante 10 minutos seguido de un lavado de 10 minutos en PBS. A continuación, incubar las muestras en solución de bloqueo que contengan 5% de suero y 0,3% detergente no iónico en PBS durante 1 hora seguido de etiquetado nocturno a 4 grados Centígrados con los anticuerpos primarios de interés adecuados.
Al día siguiente, lavar las secciones con 3 lavados de 10 minutos en PBS más Tween e incubar los portaobjetos con los anticuerpos secundarios biotinilados correspondientes a temperatura ambiente durante 1 hora después del último lavado. Al final de la incubación, lavar las secciones 3 veces en PBST fresco como acaba de demostrar e incubar las muestras con complejo de biotina peroxidasa infinita durante 40 minutos seguido de tinción con un agente cromogénico adecuado. Monte las secciones etiquetadas en portaobjetos de microscopio de vidrio y remoje los portaobjetos en etanol anhidro durante 5 minutos una vez que las secciones montadas se hayan secado por completo.
A continuación, remoje los portaobjetos en xileno durante 10 minutos y séquelos con un medio de montaje adecuado. A continuación, imagine las diapositivas con un microscopio de luz equipado con un dispositivo acoplado de carga a 100, 200 y 400 aumentos. La inmunostaining eGFP de secciones del tejido espinal cervical y lumbar revela poca o ninguna transducción en la médula espinal lumbar de ratones con una puntuación de debilidad de 0, transducción ligeramente mejorada en ratones con una puntuación de debilidad de 1, y transducciones fuertes y generalizadas en ratones con una puntuación de debilidad de 4 o 5.
La cuantificación de la intensidad de tinción de la PFNM de las secciones del tejido de la médula espinal de ratones que muestran varios grados de debilidad transitoria de las extremidades indica que la gravedad de la debilidad después de la inyección de la solución del virus se correlaciona estrechamente con la extensión de la transducción de la médula espinal. En el cerebro, se detectan señales eGFP robustas en la bombilla olfativa, la corteza prefrontal dorsolateral, el giro denato y la zona CA3 del hipocampo, la corteza cerebelosa y las zonas marginales del tronco cerebral, incluyendo el núcleo facial, el plexo coroideo y las células epiteliales ependimales. Las neuronas motoras en los cuernos anteriores también se trans inducen fuertemente en diferentes niveles de la médula espinal.
Además, en la corteza, se detectan neuronas positivas de GFP, incluidas las células piramidales, así como varios tipos de células gliales, como microglia, astrocitos y oligodendrocitos. Esta técnica permite a los investigadores en el campo de la neurología explorar los efectos terapéuticos del parto intratecal directo en pequeños animales despiertos en enfermedades del sistema nervioso central.
