Bu yöntem, ALS gibi merkezi sinir sistemi hastalıklarının deneysel tedavisi için uyanık küçük hayvanlarda adeno-ilişkili viral transgenlerin etkin intratekal teslimini kolaylaştırır. Bu yöntemin en büyük avantajı viral çözelti başarılı bir enjeksiyon dan sonra geçici bir felç neden olur% 1 lidokain hidroklorür içerir olmasıdır. Bu yöntem intratekal otomatik durumun başarısını değerlendirmek için görsel bir gösterge sağlasa da, teslimatın başarı oranını artırmak için yeterli uygulama şarttır.
İşleme başlamadan önce, 25 mikrolitrelik Hamilton şırıngasına 27 kalibrelik bir iğne takın ve iğnenin yontucuucunu şırıngadaki hacimsel ölçekle hizala. Daha sonra, virüs çözeltisinin 10.genom kopyalarını şırıngaya dikkatlice yükleyin ve kabarcıklardan kaçınmaya özen din. Sonra, bir biyogüvenlik başlık eğilimli pozisyonda bir yatak parçası üzerinde bir uyanık 30 ila 70 günlük 12-30 gram fare yerleştirin ve fare sakin ve ısırılmadan kaçınmak için steril gazlı bez ile üst vücut kapağı.
Sıkıca bir tarafta başparmak ve diğer tarafta işaret parmağı ve orta parmak bir başparmak ve işaret parmağı ile ikili pelvik korseler arasında cilt tutmak ile pelvik korse üzerinde fare kavrama. Sonra ikili pelvik korseler arasında kürk tıraş ve bir iyot bazlı scrub ve% 70 etanol ile maruz kalan cilt sterilize. Adeno ile ilişkili virüs çözeltisinin doğrudan intratekal iletimi için, bilateral pelvik korseler arasındaki orta hat boyunca intervertebral uzayı palpate ve L5-L6 intervertebral uzayı göstermek için cilde bir girintiyi bastırmak için bir tırnak kullanın.
Omurganın orta çizgisini ortaya çıkarmak ve iğnenin eğimini hayvanın kafasına doğru ayarlamak için kuyruk tabanını hafifçe ve hafifçe döndürün. Fare sıkıca konumlandırılırken, iğneyi omurganın orta hattı boyunca hizalayın ve iğneyi girintinin merkezine yavaşça ve dikey olarak yerleştirin ve şırıngayı merkezi bir sagittal düzlemde tutarak yerleştirin. İğne kemikle temas ettiğinde, açıyı yavaşça yaklaşık 30 dereceye düşürün ve iğneyi omurgasız uzaya kaydırın.
Ani bir kuyruk hareketi intradural alana başarılı bir girişin işaretidir. İğne intervertebral uzaya girdiğinde, ucu sıkıca kenetlenmiş hissedeceksiniz. Vektör çözeltisini enjekte edin ve iğneyi intradural boşlukta bir dakika koruyun.
Daha sonra sızıntıyı en aza indirmek için yavaşça dönme ile iğneyi geri çekin. Enjeksiyon kalitesini değerlendirmek için fare uzuvlarının geçici zayıflığını hemen skorlayın ve felcinden kurtulması için fareyi kafesine geri döndürün. Uygun deneysel bitiş noktasında, bir köpük kutusu kapağı üzerinde eğilimli pozisyonda ekstremite ve enjekte farenin başını düzeltmek ve şerit ve sakrum için baş deri kaldırmak için makas kullanın.
Kafatasını gözler inara, kafatasının orta çizgisi boyunca ve beyincik üzerindeki yatay çizgiyi kesve kafatasını her iki tarafta da açın. Oksipital kemik kaldırmak ve bilateral spinal kanal açmak için oftalmik makas kullanmak için cımbız kullanın. Her iki tarafta kaburga kesin ve dikkatle omurüst kısmını çıkarın.
Beyni kaldırmak ve kafatası tabanının sinirlerini kesmek için kavisli cımbız kullanın. Sonra dikkatle tüm beyin ve omurilik ayıklayın ve 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit dokuları düzeltmek. Fiksasyon döneminin sonunda, 4 santigrat derecede bir gecede %30 sakaroz çözeltisinde beyni ve servikal ve lomber omuriliği kriyoprotectt ve ardından sıvı nitrojende ani donma işleminden önce optimum kesme sıcaklığı bileşime katıştırma sağlar.
Daha sonra her dokunun 25 mikrometre kalınlığında kesitleri elde etmek için bir kriyostat kullanın, onlar elde edilir gibi 0.01 molar PBS dondurulmuş bölümleri depolamak. Dokuların immünohistokimyasal analizi için, 10 dakika boyunca %1 hidrojen peroksit ile serbest yüzen bölümleri ve ardından PBS'de 10 dakikalık bir yıkama yapın. Daha sonra pbs%5 serum ve %0.3 non-iyonik deterjan içeren bloklama solüsyonundaki numuneleri 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve ardından uygun primer antikorlarla 4 santigrat derecede geceleme etiketi ni takip edin.
Ertesi gün, PBS artı Tween 3 10 dakikalık yıkar ile bölümleri yıkayın ve son yıkamadan sonra 1 saat boyunca oda sıcaklığında uygun biyotinylated ikincil antikorlar ile slaytlar inkübül. Kuluçka sonunda, sadece gösterildiği gibi taze PBST bölümleri 3 kez yıkayın ve sonsuzbiotin peroksidaz kompleksi ile örnekleri kuluçka 40 dakika sonra uygun bir kromojenik ajan ile boyama. Etiketli bölümleri cam mikroskop slaytlarına monte edin ve atlı bölümler tamamen kuruduktan sonra slaytları 5 dakika boyunca susuz etanolle ıslatın.
Daha sonra slaytları 10 dakika ksilene batırın ve uygun bir montaj ortamı ile kapatın. Daha sonra slaytları 100, 200 ve 400 kat büyütülmüş bir şarjlı cihazla donatılmış bir ışık mikroskobuyla görüntüleyin. servikal ve lomber omurilik kesitlerinin eGFP immünboylelemi, 0 zayıflık skoru olan farelerin lomber omuriliğinde çok az veya hiç transdüksiyon, zayıflık skoru 1 olan farelerde biraz gelişmiş transdüksiyon ve 4 veya 5 zayıflık puanı olan farelerde güçlü ve yaygın transdüksiyonu ortaya koymaktadır.
Geçici ekstremite zayıflığı nın çeşitli derecelerde gösteren farelerden omurilik dokusu bölümlerinin GFP boyama yoğunluğunun ölçülmesi, virüs çözeltisi enjeksiyonundan sonra zayıflığın şiddetinin omurilik transdüksiyonunun kapsamıyla yakından ilişkili olduğunu gösterir. Beyinde, sağlam eGFP sinyalleri koku ampul tespit edilir, dorsolateral prefrontal korteks, dentate girus, ve hipokampus CA3 bölgesi, serebellar korteks, ve beyin sapının marjinal alanları, yüz çekirdeği de dahil olmak üzere, koroid pleksus, ve ependymal epitel hücreleri. Ön boynuzlarda motor nöronlar da güçlü omurilik farklı düzeylerde transdükelenir.
Ayrıca, kortekste, piramidal hücreler de dahil olmak üzere GFP pozitif nöronlar yanı sıra mikroglia, astrositler ve oligodendrocytes dahil olmak üzere çeşitli glial hücre tipleri tespit edilir. Bu teknik, nöroloji alanındaki araştırmacıların küçük uyanık hayvanlarda doğrudan intratekal doğumun merkezi sinir sistemi hastalıkları üzerindeki terapötik etkilerini keşfetmelerini sağlar.
