Este método facilita a eficiente entrega intratecal de transgênicos virais associados ao adeno em animais de pequeno porte acordados para o tratamento experimental de doenças do sistema nervoso central, como a ELA. A principal vantagem deste método é que a solução viral inclui cloridrato de 1%lidocaína que induz uma paralisia transitória após uma injeção bem sucedida. Embora este método forneça um indicador visual para julgar o sucesso da situação automatizada intratecal, a prática suficiente é essencial para melhorar a taxa de sucesso da entrega.
Antes de iniciar o procedimento, conecte uma agulha de calibre 27 a uma seringa Hamilton de 25 microliter e alinhe a ponta chanfrada da agulha com a balança volumosa na seringa. Em seguida, carregue cuidadosamente 8 microliters de 4 x 10 para o décimo genoma cópias da solução do vírus na seringa, tomando cuidado para evitar bolhas. Em seguida, coloque um rato acordado de 30 a 70 dias de idade de 12 a 30 gramas em uma peça de cama na posição propensa em um capô biossegurança e cubra o corpo superior com gaze estéril para acalmar o rato e evitar ser mordido.
Segure firmemente o mouse em sua cinta pélvica com o polegar de um lado e o dedo indicador e o dedo médio do outro lado mantendo a pele entre as cintas pélvicas bilaterais esticada com um polegar e dedo indicador. Em seguida, raspe a pele entre as cintas pélvicas bilaterais e esterilize a pele exposta com um esfoliante à base de iodo e 70% de etanol. Para a entrega intratecal direta da solução de vírus associada ao adeno, palpa o espaço intervertebral ao longo da linha média entre as cintas pélvicas bilaterais e use uma unha para deprimir uma recuo na pele para indicar o espaço intervertebral L5 a L6.
Gire a base da cauda ligeiramente e suavemente para revelar a linha média da coluna vertebral e ajustar o bisel da agulha em direção à cabeça do animal. Com o mouse firmemente posicionado, alinhe a agulha ao longo da linha média da coluna vertebral e insira a agulha suave e verticalmente no centro do recuo mantendo a seringa em um plano sagital central. Quando a agulha entrar em contato com o osso, diminua lentamente o ângulo para aproximadamente 30 graus e deslize a agulha para o espaço intervertebral.
Um súbito movimento de cauda é um sinal de uma entrada bem sucedida no espaço intradural. Quando a agulha entrar no espaço intervertebral, a ponta se sentirá firmemente presa. Injete a solução vetorial e mantenha a agulha dentro do espaço intradural por um minuto.
Em seguida, retire lentamente a agulha com rotação para minimizar o vazamento. Escore imediatamente a fraqueza transitória dos membros do rato para avaliar a qualidade da injeção e devolver o mouse à sua gaiola para recuperação da paralisia. No ponto final experimental apropriado, fixar os membros e a cabeça do rato injetado na posição propensa em uma tampa de caixa de espuma e usar uma tesoura para tirar e remover a pele da cabeça para o sacro.
Corte o crânio entre os olhos, corte ao longo da linha média do crânio e a linha horizontal acima do cerebelo e abra o crânio de cada lado. Use pinças para remover o osso occipital e use uma tesoura oftálmica para abrir bilateralmente o canal espinhal. Corte as costelas em ambos os lados e remova cuidadosamente a parte superior das vértebras.
Use pinças curvas para levantar o cérebro e cortar os nervos da base do crânio. Em seguida, extrair cuidadosamente todo o cérebro e medula espinhal e fixar os tecidos em 4% de paraformaldeído por 24 horas. Ao final do período de fixação, crioprotege o cérebro e a medula espinhal cervical e lombar em solução de 30% de sacarose durante a noite a 4 graus Celsius seguido de incorporação no composto de temperatura de corte ideal antes de quebrar o congelamento em nitrogênio líquido.
Em seguida, use um criostat para obter seções de 25 micrômetros de espessura de cada tecido, armazenando as seções congeladas em PBS molar de 0,01 a 4 graus Celsius à medida que são obtidas. Para análise imunohistoquímica dos tecidos, pré-trar as seções flutuantes livres com peróxido de hidrogênio de 1% por 10 minutos seguido de uma lavagem de 10 minutos em PBS. Em seguida, incubar as amostras em solução de bloqueio contendo 5% de soro e detergente não iônico de 0,3% na PBS por 1 hora, seguido pela rotulagem noturna a 4 graus Celsius com os anticorpos primários de interesse apropriados.
No dia seguinte, lave as seções com lavagens de 3 10 minutos em PBS mais Tween e incuba os slides com os anticorpos secundários biotinilados correspondentes apropriados à temperatura ambiente por 1 hora após a última lavagem. Ao final da incubação, lave as seções 3 vezes em PBST fresco como apenas demonstrado e incuba as amostras com complexo de peroxidase de biotina infinita por 40 minutos seguido de coloração com um agente cromogênico apropriado. Monte as seções rotuladas em lâminas de microscópio de vidro e mergulhe os slides em etanol anidro por 5 minutos, uma vez que as seções montadas tenham secado completamente.
Em seguida, mergulhe os slides em xileno por 10 minutos e sele-os com um meio de montagem apropriado. Em seguida, imagem os slides com um microscópio de luz equipado com um dispositivo acoplado a carga em 100, 200 e 400 vezes ampliações. A imunostaining eGFP de seções de tecido medular cervical e lombar revela pouca ou nenhuma transdução na medula espinhal lombar de camundongos com um escore de fraqueza de 0, transdução ligeiramente aumentada em camundongos com um escore de fraqueza de 1, e transduções fortes e generalizadas em camundongos com um escore de fraqueza de 4 ou 5.
A quantificação da intensidade de coloração do GFP das seções de tecido medular de camundongos que apresentam vários graus de fraqueza transitória dos membros indica que a gravidade da fraqueza após a injeção da solução do vírus se correlaciona estreitamente com a extensão da transdução da medula espinhal. No cérebro, sinais robustos de eGFP são detectados na lâmpada olfativa, córtex pré-frontal dorsolateral, giro dentado e na zona CA3 do hipocampo, córtex cerebelar e áreas marginais do tronco cerebral, incluindo o núcleo facial, plexo choroide e as células epiteliais ependímicas. Os neurônios motores nos chifres anteriores também são fortemente transduzidos em diferentes níveis da medula espinhal.
Além disso, no córtex, os neurônios positivos GFP, incluindo células piramiadas, são detectados, bem como vários tipos de células gliais, incluindo microglia, astrócitos e oligodenrócitos. Essa técnica permite que pesquisadores da área de neurologia explorem os efeitos terapêuticos do parto intratecal direto em pequenos animais acordados em doenças do sistema nervoso central.
