この方法は、ALSなどの中枢神経系疾患の実験的処置のために、覚醒小動物におけるアデノ関連ウイルストランス遺伝子の効率的なアデノ関連ウイルストランス遺伝子の効率的な内腔送達を促進する。この方法の主な利点は、ウイルス溶液が正常に注射した後に一過性麻痺を誘発する1%リドカイン塩酸塩を含むということです。この方法は、自動状態の結果を判断するための視覚的な指標を提供するが、配信の成功率を向上させるためには十分な練習が不可欠である。
手順を開始する前に、27マイクロリットルのハミルトン注射器に27ゲージの針を取り付け、針のベベリング先端をシリンジの容積スケールに合わせます。その後、慎重に気泡を避けるために注意して、注射器にウイルス溶液の10番目のゲノムコピーに4 x 10の8マイクロリットルをロードします。次に、バイオセーフティフードの起こりやすい位置にあるベッドピースの上に30〜70日齢の12〜30グラムのマウスを置き、上半身を無菌ガーゼで覆い、マウスを落ち着かせ、噛まれないようにします。
片方の側に親指を置き、反対側の人差し指と中指で骨盤ガードルの上にマウスをしっかりと握り、両側の骨盤ガードルの間の皮膚を親指と人差し指で張ります。その後、両側骨盤ガードル間の毛皮を剃り、ヨウ素ベースのスクラブと70%エタノールで露出した皮膚を殺菌する。アデノ関連ウイルス溶液の直接の内腔内送達のために、両側骨盤ガードル間の正中線に沿って椎間空間を触診し、指の爪を使用して皮膚へのインデントを抑制し、L5〜L6椎間腔を示す。
尾の基部を少し軽く回転させて背骨の正中線を明らかにし、針のベベルを動物の頭に向かって調整します。マウスをしっかりと固定して、脊椎の正中線に針を合わせ、注射器を中央の矢状平面に保つインデントの中央に針を静かに垂直に挿入します。針が骨に接触したら、ゆっくりと角度を約30度に下げ、針を椎間腔に滑り込まします。
突然の尾のフリックは、硬膜内空間への正常な入り口の兆候です。針が椎間スペースに入ると、先端はしっかりと締め付けられた感じになります。ベクター溶液を注入し、1分間硬膜内空間内で針を維持する。
その後、ゆっくりと漏れを最小限に抑えるために回転で針を引き出します。マウスの手足の一過性の弱さをすぐにスコアリングして注射の品質を評価し、マウスをそのケージに戻して麻痺から回復します。適切な実験エンドポイントで、注入されたマウスの手足と頭部をフォームボックスカバーの起こりやすい位置に固定し、はさみを使用して頭から仙点に皮膚を剥ぎ取って取り除きます。
目の間に頭蓋骨をクリップし、頭蓋骨の正中線と小脳の上の水平線に沿って切り取り、両側の頭蓋骨を開きます。後頭部骨を取り除き、眼科用はさみを使用して脊柱管を両側で開きます。両側のリブを切り、椎骨の上部を慎重に取り除きます。
湾曲したピンセットを使用して脳を持ち上げ、頭蓋骨の基部の神経を切断します。その後、慎重に脳と脊髄全体を抽出し、24時間4%パラホルムアルデヒドで組織を修正します。固定期間の終わりに、脳と子宮頸部および腰椎脊髄を摂氏4度で一晩30%スクロース溶液で凍結保護し、続いて液体窒素中で凍結する前に最適な切断温度化合物に埋め込む。
次に、クライオスタットを使用して各組織の厚さ25マイクロメートルの部分を得て、得られるように0.01モルPBSで凍結したセクションを摂氏4度で保存する。組織の免疫組織化学的分析のために、1%過酸化水素で遊離浮遊部を10分間退出し、続いてPBSで10分間洗浄する。次に、PBSに5%血清および0.3%非イオン性洗剤を含むブロッキング溶液中のサンプルを1時間インキュベートし、その後、適切な一次抗体を有する摂氏4度で一晩標識する。
翌日、PBSとTweenで3 10分の洗浄でセクションを洗浄し、最後の洗浄後1時間室温で適切な対応するビオチン化二次抗体でスライドをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、ちょうど実証したように新鮮なPBSTで3回セクションを洗浄し、40分間インフィニティビオチンペルオキシダーゼ複合体でサンプルをインキュベートし、適切な発色剤で染色します。ラベル付き切片をガラス顕微鏡スライドに取り付け、取り付けられた切片が完全に乾燥したら、スライドを無水エタノールに5分間浸します。
次に、スライドをキシレンに10分間浸し、適切な取り付け媒体で密封します。その後、100、200、400倍の倍率で電荷結合装置を装備した軽い顕微鏡でスライドをイメージします。子宮頸部および腰椎脊髄組織切片のeGFP免疫染色は、弱点スコア0のマウスの腰椎脊髄への伝達をほとんどまたは全く明らかにし、弱点スコア1のマウスではわずかに増強された伝達、および弱点スコア4または5のマウスで強く広範な伝達を明らかにする。
種々の一時的な肢の弱さを示すマウスからの脊髄組織切片のGFP染色強度の定量化は、ウイルス溶液注射後の弱点の重症度が脊髄伝達の程度と密接に相関することを示している。脳では、嗅球、側側前頭前野、デンテート回、海馬、小脳皮質、脳幹の限界領域(顔面核、脈絡膜叢、および頭蓋上皮細胞を含む)のCA3ゾーンで、堅牢なeGFP信号が検出される。前角の運動ニューロンも脊髄の異なるレベルで強く伝達される。
また、皮質では、ミクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを含む様々なグリア細胞タイプと同様に、錐体細胞を含むGFP陽性ニューロンが検出される。この技術により、神経学分野の研究者は、中枢神経系疾患に対する小さな覚醒動物の直接眼内送達の治療効果を探究することができる。
