שיטה זו מאפשרת אספקה תוך-פתאתקלית יעילה של מהוומני נגיפיים הקשורים לאדונו בבעלי חיים קטנים ערים לטיפול ניסיוני במחלות של מערכת העצבים המרכזית כגון ALS. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי הפתרון הנגיפי כולל 1%lidocaine הידרוכלוריד אשר גורם שיתוק חולף לאחר זריקה מוצלחת. למרות ששיטה זו מספקת אינדיקטור חזותי לשיפוט ההצלחה של המצב האוטומטי האינטרתתקלי, תרגול מספיק חיוני לשיפור שיעור ההצלחה של המסירה.
לפני תחילת ההליך, לצרף מחט מד 27 למזרק המילטון 25 microliter וליישר את הקצה משופע של המחט עם סולם נפחי על המזרק. ואז בזהירות לטעון 8 microliters של 4 x 10 עותקים הגנום העשירי של פתרון הנגיף לתוך המזרק, דואג להימנע בועות. לאחר מכן, מניחים עכבר ער בן 30 עד 70 יום 12 עד 30 גרם על חתיכת מיטה בתקורה נוטה במכסה המנוע biosafety ולכסות את הגוף העליון עם גזה סטרילית כדי להרגיע את העכבר כדי למנוע ננשך.
אחז בחוזקה בעכבר על מחוך האגן שלו עם האגודל בצד אחד והאצבע האמצעית והאצבע האמצעית בצד השני, תוך שמירה על העור בין מחוכי האגן הדו-צדדיים מתוחים עם אגודל ואצבע. לאחר מכן לגלח את הפרווה בין מחוכים האגן הדו-צדדיים ולעקר את העור החשוף עם קרצוף מבוסס יוד ו 70% אתנול. למסירה פנימית ישירה של פתרון הנגיף הקשור לאדונו, יש למחוץ את המרחב הבין חולייתי לאורך קו האמצע בין מחוך האגן הדו-צדדי ולהשתמש בציפורניים כדי לדכא כניסה לתוך העור כדי לציין את החלל הבין חולייתי L5 עד L6.
סובב את בסיס הזנב מעט בעדינות כדי לחשוף את קו האמצע של עמוד השדרה ולהתאים את השיפה של המחט לכיוון ראש החיה. עם העכבר קבוע בחוזקה למקומו, ליישר את המחט לאורך קו האמצע של עמוד השדרה ולהכניס את המחט בעדינות ואנכית למרכז הכניסה שמירה על המזרק במישור קשת מרכזי. כאשר המחט באה במגע עם העצם, לאט לאט להקטין את הזווית כ 30 מעלות להחליק את המחט לתוך החלל הבין חולייתי.
תנועה פתאומית בזנב היא סימן לכניסה מוצלחת לחלל התוך-טבעי. כאשר המחט נכנסת לחלל הבין חולייתי, הקצה ירגיש מהודק היטב. להזריק את הפתרון הווקטורי, ולשמור על המחט בתוך החלל התוך-עורי במשך דקה אחת.
ואז לאט למשוך את המחט עם סיבוב כדי למזער את הדליפה. מיד ציון החולשה החולף של גפי העכבר כדי להעריך את איכות ההזרקה ולהחזיר את העכבר לכלוב שלה להתאוששות מן השיתוק. בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, לתקן את הגפיים ואת הראש של העכבר מוזרק במצב נוטה על כיסוי תיבת קצף ולהשתמש מספריים כדי להסיר את העור מהראש אל sacrum.
חותכים את הגולגולת בין העיניים, חותכים לאורך קו האמצע של הגולגולת ואת הקו האופקי מעל המוח הקטן ולפתוח את הגולגולת מכל צד. השתמש פינצטה כדי להסיר את העצם העורפית ולהשתמש מספריים עיניים כדי לפתוח את תעלת עמוד השדרה דו צדדית. חותכים את הצלעות משני הצדדים ומסירים בזהירות את החלק העליון של החוליות.
השתמש פינצטה מעוגלת כדי להרים את המוח ולנתק את העצבים של בסיס הגולגולת. ואז בזהירות לחלץ את המוח כולו ואת חוט השדרה ולתקן את הרקמות ב 4% paraformaldehyde במשך 24 שעות. בסוף תקופת הקיבוע, cryoprotect המוח ואת חוט השדרה צוואר הרחם המותני ב 30% פתרון סוכרוז לילה ב 4 מעלות צלזיוס ואחריו הטבעה תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית לפני הצמד הקפאה בחנקן נוזלי.
לאחר מכן להשתמש cryostat כדי להשיג 25 חלקים עבים מיקרומטר של כל רקמה, אחסון החלקים הקפואים ב 0.01 PBS טוחן ב 4 מעלות צלזיוס כפי שהם מתקבלים. לניתוח אימונוהיסטוכימי של הרקמות, יש לפנות את החלקים הצפים החופשיים עם 1%מי חמצן למשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף 10 דקות ב-PBS. הבא דגירה הדגימות בתת פתרון חסימה המכיל 5%סרום ו 0.3% דטרגנט לא יוני ב PBS במשך שעה אחת ואחריו תיוג לילה ב 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים המתאימים של עניין.
למחרת, לשטוף את החלקים עם 3 10 דקות שוטף PBS בתוספת Tween ולהדקר את המגלשות עם נוגדנים משניים biotinylated המתאים בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה לאחר לשטוף האחרון. בסוף הדגירה, לשטוף את החלקים 3 פעמים PBST טרי כפי שהודגם רק להדגים את הדגימות עם קומפלקס פרוקסידאז ביוטין אינסוף במשך 40 דקות ואחריו כתמים עם סוכן כרומוגני המתאים. הר את החלקים המסווים על מגלשות מיקרוסקופ זכוכית להשרות את המגלשות באתנול נטול מים במשך 5 דקות לאחר החלקים רכוב התייבש לחלוטין.
הבא להשרות את השקופיות קסילן במשך 10 דקות ולאטום אותם עם מדיום הרכבה מתאים. לאחר מכן דמיין את השקופיות עם מיקרוסקופ קל המצויד במטען יחד עם הגדלות של 100, 200 ו- 400 פעמים. eGFP immunostaining של חלקי רקמת חוט השדרה צוואר הרחם המותני מגלה טרנסדוקציה קטנה או ללא טרנסדוקציה בחוט השדרה המותני של עכברים עם ציון חולשה של 0, טרנסדוקציה משופרת במקצת בעכברים עם ציון חולשה של 1, ותמרים חזקים ונרחבים בעכברים עם ציון חולשה של 4 או 5.
כימות עוצמת הכתמים של GFP של מקטעי רקמת חוט השדרה מעכברים המציגים דרגות שונות של חולשת גפיים ארעית מצביע על כך שחומרת החולשה לאחר הזרקת פתרון הנגיף תואמת באופן הדוק את היקף ההעתקה של חוט השדרה. במוח, אותות eGFP חזקים מזוהים בנורה חוש הריח, קליפת המוח הקדם-מצחית הגבית-מצחית, gyrus שקע, ואת אזור CA3 של ההיפוקמפוס, קליפת המוח הקטן, ואת האזורים השוליים של גזע המוח, כולל גרעין הפנים, מקלעת choroid, ואת תאי האפיתל ependymal. נוירונים מוטוריים בקרניים לפנים הם גם מתמר בחוזקה ברמות שונות של חוט השדרה.
יתר על כן, בקליפת המוח, נוירונים חיוביים GFP כולל תאים פירמידליים מזוהים, כמו גם סוגים שונים של תאי גליה כולל microglia, אסטרוציטים, ו oligodendrocytes. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום הנוירולוגיה לחקור את ההשפעות הטיפוליות של מסירה תוך-תיתטית ישירה בבעלי חיים ערים קטנים על מחלות של מערכת העצבים המרכזית.
