Los aislamientos de poblaciones genuinas de células de inversión apoptóticas han sido un problema anteriormente, lo que limita en gran medida nuestra comprensión sobre las consecuencias de la reversión de la apoptosis. Este protocolo nos permite generar poblaciones más puras de células de inversión apoptóticas. La principal ventaja de esta técnica es que los materiales y equipos utilizados están ampliamente disponibles en diferentes instituciones.
Esta técnica es fácilmente aplicable para aislar a una población más pura de células que han sufrido la reversión de la apoptosis. Como se informó anteriormente, las células normales también pueden pasar a ser reescrones de apoptosis, que aparte de las células de cáncer de mama, diferentes células quimio, así como las células normales, se pueden iniciar y los diversos estímulos apoptóticos se pueden utilizar. Debido a que la célula de reversión ha pasado por la apoptosis y la clasificación rápida, la tasa de recuperación suele ser baja.
Un número de celda inicial más grande es recombinante para aumentar el rendimiento final. Para empezar, haga referencia a las celdas MCF-7, MDA-MB-231, Para comenzar, haga referencia a la cultura MCF-7, MDA-MB-231 y T47D, según el protocolo de texto. Después de esto, lavar las células con PBS dos veces, luego añadir dos mililitros de 0.05 por ciento de trippsina-EDTA de 0.05 por ciento de trippsina-EDTA al MCF-7, y células MDA-MB-231, a las células MCF-7 y MDA-MB-231, y dos mililitros de 0.25 por ciento de trippsina-EDTA y dos mililitros de 0.25 por ciento trypsin-EDTA a las células T47D.
a las células T47D. Cultivo de las células durante cinco minutos a 37 grados Celsius, en una incubadora de cultivo celular de dióxido de carbono cinco por ciento. Mientras las células incuban, compruebe el desprendimiento de las células con un microscopio para prevenir la sobre-digestión por la trippsina-EDTA.
Cuando más del 90 por ciento de las células se separan, agregue cinco mililitros de medio RPMI completado al plato y pipetearlo sobre la superficie de la capa celular varias veces. Luego, transfiera las células a tubos cónicos de 15 mililitros y centrífuga. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los pellets con tampón FACS en tubos de micro centrífuga de 1,5 mililitros.
Luego, divida las células en varios tubos. Centrifugar los tubos una vez más, y desechar el sobrenadante. A continuación, agregue el bloque Fc diluido a las muestras.
Incubar las muestras sobre hielo en la oscuridad durante 20 minutos, antes de centrifugar las muestras de nuevo. Después de esto, deseche el sobrenadante. A continuación, añada anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo contra CD44 humano, y CD24, contra CD44 humanos, y CD24, en uno a 40, y de uno a 10 diluciones, respectivamente, a los grupos de doble tinción.
Para los controles positivos, agregue anticuerpos CD44 Para los controles positivos, agregue anticuerpos CD44 a las células MDA-MB-231, a las células MDA-MB-231, y anticuerpos CD24 a las células MCF-7 y anticuerpos CD24 a las células MCF-7 en una a 40, y a una a 10 diluciones, respectivamente. Añadir PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, Añadir PerCP-Cy5.5 Ratón IgG2b Kappa, diluido en una proporción de uno a 40 a las células como un control de isótopos para anticuerpos CD44. Luego, agregue PE Mouse IgG2a Kappa, Then, agregue PE Mouse IgG2a Kappa, diluido en una proporción de uno a 10 a las células como control de isótopos para anticuerpos CD24.
Incubar las muestras a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante 30 minutos. Luego, centrifugar las muestras a 300 g's Then, centrifugar las muestras a 300 g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y lave el pellet dos veces en 500 micro litros de PBS.
A continuación, repita la centrifugación como se describió anteriormente. Vuelva a suspender el pellet en 0,5 mililitros de PBS y filtre la suspensión a través de una malla de nylon de 40 micrómetros. A continuación, ejecute la suspensión a través de un clasificador de células activado por fluorescencia.
Recoger las células con CD44 negativo, y marcadores positivos CD24 en tubos de fondo redondo que contienen un mililitro de medio de recolección. Luego, centrifuga los tubos, y deseche el sobrenadante. A continuación, plancha las células cancerosas de mama no madre ordenadas en un plato de cultivo que contenga un medio de recolección fresco para un mayor cultivo.
En primer lugar, utilizar una estaurosporina milimolar en DMSO, Para preparar 2,5 micromolares estaurosporina en medio, de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, elimine el medio de cultivo de las celdas. Lavar las células con dos mililitros de PBS una vez, después de esto, añadir 10 mililitros del medio de estaurosporina a las células MSF-7 durante seis horas, para inducir apoptosis, cuando las células son 70 por ciento confluentes.
A continuación, prepare un paclitaxel mililar en DMSO. Luego, agregue 12,5 micro litros Luego, agregue 12,5 micro litros del paclitaxel 1 milimolar al medio completo de las células T47D para hacer un volumen final de 10 mililitros en un tubo cónico de 15 mililitros. Retire el medio de cultivo de las células y lave las células con 2 mililitros de PBS.
Luego, agrega el medio paclitaxel a las células durante 10 horas para inducir apoptosis durante 10 horas para inducir apoptosis cuando las células alcanzan el 70 por ciento de confluencia. Después de esto, retire el medio del grupo MCF-7 tratado con disolvente y lávelos con dos mililitros de PBS. A continuación, añadir 10 mililitros de 0.25 por ciento dmSO medio Entonces, añadir 10 mililitros de 0.25 por ciento DMSO medio durante seis horas como el control de disolvente para estaurosporina.
Retire el medio de cultivo del grupo T47D tratado con disolvente y lave las células con dos mililitros de PBS. A continuación, agregue 10 mililitros de 0,05 por ciento de medio DMSO Entonces, agregue 10 mililitros de 0,05 por ciento de DMSO medio durante 10 horas como control de disolvente para paclitaxel. A continuación, manchar la célula y incubarla durante 20 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono del cinco por ciento.
Utilice un microscopio de escaneo láser confocal 60 veces para observar los cambios morfológicos de las células tratadas. Mancha tanto el inductor apoptótico como las células MCF-7 y T47D tratadas con disolvente y las células MCF-7 y T47D tratadas con disolvente en la oscuridad durante 30 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono del cinco por ciento. Usando el clasificador de células activado por fluorescencia, recoja las células positivas de los grupos tratados con el inductor en tubos inferiores redondos que contengan un mililitro de medio de recolección.
A continuación, centrifugar los tubos como se describió anteriormente, y deseche el sobrenadante. Recoger las células negativas de los grupos tratados con disolvente en tubos de fondo redondo con un mililitro de medio de recolección. Centrifugar los tubos y desechar el sobrenadante.
Después de esto, vuelva a suspender las celdas ordenadas en el medio de recolección fresco. Siembra las células en placas de cultivo de tejido de 12 pozos, y cultiva durante siete días para la reversión de la apoptosis. Cosecha el MCF-7 invertido en grupos inductores y tratados con disolvente con 0.05 por ciento de trippsina-EDTA.
con 0.05 por ciento de trippsina-EDTA. Luego, cosechar las células T47D en ambos inductores Entonces, cosechar las células T47D en grupos inductores y tratados con disolvente con 0.25 por ciento de trippsina-EDTA. Manche las células con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo contra CD44 y CD24 humanos.
Mientras las células se manchan, prepare los controles de isotipo como se ha demostrado anteriormente. Finalmente, ejecute las células en un citómetro de flujo y detecte el porcentaje de células con marcadores CD44 positivos y CD24 negativos. En este protocolo, se observó la transición de las células cancerosas mamarias no madre a las células similares a las CSC de mama.
El aislamiento de las células cancerosas no madres se realizó por primera vez en células MCF-7. Se observaron cambios morfológicos típicos después de agregar inductores apoptóticos, y las células se recuperaron de la apoptosis con morfología similar después de la retirada del fármaco. Las células activadas por el caspace fueron etiquetadas y ordenadas en función de su intensidad de fluorescensa más alta que las células sin activación del caspace.
Durante el proceso de inducción apoptótica, se utilizó solvente para excluir la posibilidad de que el procedimiento hecho, o el disolvente en sí, fuera la causa de la transición. Se encontró que las células activadas por Caspace en los grupos de tratamiento de inductores apoptóticos eran una nexina cinco positivas y PI negativas, lo que sugiere que eran células apoptóticas. Las células apoptóticas fueron recolectadas y cultivadas para su recuperación, en comparación con los grupos tratados con disolventes, el análisis citométrico de flujo mostró que había células que aparecían en el cuadrante positivo CD44 y CD24 negativo en la población de células cancerosas no madres invertidas originalmente.
La medición es importante en el análisis de flujo y la clasificación celular, que se debe preparar un control suficiente en los laboratorios. Dado que este procedimiento de reversión de apoptosis in vitro aísla las células cancerosas apoptóticas puras, se pueden llevar a cabo experimentos como los activos de la tumorigenesis in vivo para comprender las consecuencias de revertir las células. Esta técnica arroja luz sobre la causa de la recaída del cáncer, por lo tanto, se puede investigar para prevenir potencialmente la reaparia en pacientes con cáncer.
Recuerde protegerse adecuadamente al realizar experimentos de cultivo celular de acuerdo con las regulaciones de nivel de bioseguro en su institución.
