Nuestro protocolo proporciona un método simple para el cultivo celular 3D y es altamente susceptible al análisis posterior. Esto facilita la evaluación de muestras heterogéneas de pacientes y sus respuestas específicas a los medicamentos. La ventaja de esta técnica es que los esferoides se pueden formar a partir de números de células pequeñas, lo que permite tanto la preservación de muestras primarias escasas, como un cribado de alto rendimiento para las respuestas de fármacos específicos del paciente.
El modelo de gota colgante crea un entorno fisiológico con difusión de fármacos 3D y hace respuestas correspondientes a la etapa tumoral. Esto permite el desarrollo de terapias dirigidas y tratamientos específicos para el paciente. Este método es ideal para estudiar el cáncer de ovario, la heterogeneidad y el desarrollo de la resistencia a la quimio.
Sin embargo, también se puede utilizar para estudiar otros tipos de cáncer y poblaciones de células resistentes a los medicamentos. Al enchapar los esferoides, es importante pipetear volúmenes precisos. Esto garantiza la consistencia entre los esferoides.
Los esferoides y sus respectivas gotas son inherentemente frágiles y se pierden fácilmente sin un manejo adecuado, por lo tanto vamos a mostrar cómo placar adecuadamente, mantener y analizar una placa colgante. Demostrar este procedimiento estará Michael Bregenzer, un estudiante graduado de nuestro laboratorio. Comience llenando cada pozo de la placa de seis pozos con cuatro a cinco mililitros de agua desionizada de autoclave y emparejendo la placa colgante entre la tapa y la parte inferior de la placa.
Agregue de 800 a 1000 microlitros de agua alrededor del borde de la placa colgante para proporcionar un ambiente húmedo y minimizar la evaporación. A continuación, recoja las células cultivadas en 2D desprendiéndolas con trippsina, y luego agregando seis u ocho mililitros de medio que contenga FBS. Aspirar las células con la pipeta serológica de 10 mililitros y depositarlas en un tubo cónico de 15 mililitros.
Usa un hemocitoómetro para contar las células. Preparar la suspensión celular de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y mezclar suavemente con la pipeta para asegurar una distribución homogénea. Coloque la punta de la pipeta en el pozo en un ángulo de 45 grados y pipetee 20 microlitros de suspensión en cada pozo colgante.
Coloque la tapa de la placa de seis pozos de nuevo y utilice una tira termoplástica elástica para sellar los bordes. Incubar en una incubadora humidificada de dióxido de carbono estándar y alimentar las gotas colgantes cada dos o tres días añadiendo dos a tres microlitros de medio de cultivo celular a cada pozo que contiene esferoides. Para cuantificar la proliferación y viabilidad de las células, agregue dos microlitros de solución filtrada basada en resazurina a los pozos designados para el análisis de proliferación e incubar de acuerdo con la dirección del manuscrito.
Después del período de incubación, abra el sándwich colgante en un gabinete de bioseguridad y lleve la placa de 384 pozos con la tapa todavía en su lugar al lector de placas. Colóquelo en el lector de placas y lea la placa. Guarde el experimento en la ventana emergente y exporte los datos a una hoja de cálculo.
Vuelva a colocar la placa a la base de seis pozos y colóquela en la incubadora. Una vez que todos los puntos de tiempo han sido leídos para el día, vuelva a sellar la placa antes de incubar. Para preparar los esferoides para el análisis de citometría de flujo, utilice una pipeta de 1000 microlitros para recogerlos de cada pozo y depositarlos en un tubo cónico de 15 mililitros para su desagregación.
Suspensión de células alícuotas en cinco tubos de micro centrífuga para que cada tubo contenga al menos 50.000 células. Centrifugar los tubos a 400 veces G durante cinco minutos en una microcentrífuga, luego aspirar el sobrenadante y re-suspender los pellets en 100 microlitros de tampón Aldefluor. Etiquete los tubos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Agregue 0,5 microlitros de anticuerpos de isotipo APC al tubo ISO APC y un microlitro de anticuerpo CD133 al tubo ALDH CD133. A continuación, añada cinco microlitros de reactivo DEAB y 0,5 microlitros de ALDH al tubo DEAB y un microlitros de ALDH al tubo ALDH CD133. Vórtice todos los tubos durante unos segundos e incubarlos a 37 grados centígrados durante 45 minutos.
Después de la incubación, vórtice todos los tubos de nuevo y centrifugarlos a 400 veces G durante cinco minutos. Etiquete los tubos FACS de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y llene un recipiente de espuma aislado con hielo. Aspirar el sobrenadante de los tubos de microcentrífuga.
A continuación, vuelva a suspender el control no detenido en 400 microlitros de búfer FACS y el resto de células en 400 microlitros de búfer DAPI FACS. Coloque los tubos sobre el hielo hasta que puedan ser analizados en un citometro de flujo. Utilice FlowJo para analizar los datos del citometro de flujo.
Haga doble clic en el archivo no manchado y establezca el eje Y en la altura de dispersión lateral o SSCH y el eje X para avanzar la altura de dispersión o FSCH. Haga clic en el botón T situado junto a cada eje para ajustar la escala y maximizar la separación entre diferentes poblaciones de celdas. A continuación, haga clic en el botón Polygon Gating, dibuje la puerta poligonal alrededor de la población de celdas y etiquete las celdas de población.
Haga doble clic en la población de la celda en el área de trabajo y, a continuación, cambie el eje FSC a Ancho FSC y el eje SSC a la altura FSC. Elija la puerta rectangular para dibujar solo un rectángulo alrededor de la población más densa de celdas a la izquierda, abarcando todo el eje Y. Etiquete esta puerta Celdas individuales.
A continuación, haga clic con el botón derecho y copie estas celdas en la puerta de celdas únicas anidada y péguelas debajo de cada muestra en el espacio de trabajo. Haga doble clic en la puerta Celdas únicas anidada bajo el ejemplo DAPI para ver la población de celdas individuales de ese tubo de muestra. Cambie el canal del eje FSC al canal de área DAPI y cambie el canal del eje SSC a histograma.
Haga clic en el botón T junto al eje DAPI y haga clic en Personalizar eje para ajustar la escala y maximizar la separación entre los picos daPI positivos y DAPI negativos. Haga clic en Aplicar en la ventana emergente y elija el botón Puerta de rango. Extiéndalo sobre el pico negativo DAPI y etiquete esta puerta Live Cells.
Copie la puerta Live Cells y péguela debajo de la puerta Single Cells, bajo los tubos APC ISO DEAB y ALDH CD133, para seleccionar la misma porción de células vivas en cada tubo. A continuación, haga doble clic en la población de celdas vivas anidada bajo el archivo de muestra ISO de APC y cambie el eje X al área ALDH y el eje Y al área APC. Aplique la puerta de cuadrante y ajuste la intersección de la puerta, como la que aproximadamente el 0,5% de la población se encuentra en la parte superior izquierda de la ventana de la parcela.
Luego asigne a los cuadrantes el nombre que desee, luego copie y pegue las puertas cuadrantes en la población de celdas vivas anidada bajo el archivo DEAB y ajuste la línea vertical de modo que aproximadamente el 0,15% de la población de celdas se encuentre dentro del cuadrante positivo ALDH. Por último, copie y pegue las puertas del cuadrante en los archivos ALDH CD133 Live Cells population y evaluation cancer stem proportions based on ALDH and CD133 proportions. Este protocolo se puede utilizar para el análisis de alto rendimiento de las células madre cancerosas derivadas del paciente.
Tan poco como 10 células por pozo pueden formar esferoides confiables y a medida que las células proliferan, los esferoides se expanden en tamaño. La capacidad de proliferación se puede cuantificar fácilmente con un ensayo de florescencia basado en resazurin. El efecto de los fármacos sobre la morfología esferoide se puede visualizar con imágenes de contraste de fase y cuantificarse comparando la resazurin florescencia en células no tratadas y tratadas.
La muerte celular puede validarse mediante la adición de Calcein-AM y ethidium homodimer I a los esferoides, seguido de imágenes en un microscopio confocal. Por último, los esferoides se pueden cosechar y dispersar en una sola suspensión de células para su análisis con citometría de flujo, lo que permite discernir la eficacia de diferentes tratamientos farmacológicos en poblaciones celulares específicas. Para evitar la pérdida de gotas, la evaporación media y la variación en el tamaño del esferoide, es importante manejar sus placas con cuidado, pipeta con precisión y sellar completamente sus placas colgantes.
Para evaluar los cambios en la expresión génica y la señalización soluble debido al tratamiento farmacológico, se puede utilizar la secuenciación de ARN de una sola célula y los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas para facilitar el desarrollo de terapias. Esta técnica permite a las investigaciones en oncología, medicina de precisión y desarrollo de fármacos explorar la heterogeneidad intra e inter pacientes, así como la resistencia a la quimio a través de la detección de fármacos de alto rendimiento de pequeñas biopsias. Al realizar este protocolo, asegúrese de usar todos los equipos de protección personal estándar.
Incluye guantes, gafas de seguridad, abrigos de laboratorio, pantalones y zapatos de los dedos cerrados.
