La fotoconversión proporciona un método in vivo rastreable para el análisis cuantitativo de la salida de leucocitos para una visión mecanicista de la residencia de leucocitos y la dinámica de salida de múltiples sitios de tejido en estados enfermos. Bueno, aquí demostramos la utilidad del seguimiento de leucocitos de tumores cutáneos. La aplicación de este ensayo a otros tejidos y enfermedades está limitada sólo por la capacidad de administrar la luz.
La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación de poblaciones endógenas, en lugar de células inmunitarias transferidas como una salida de tejidos inflamados in vivo. Para inducir la inflamación, después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del otro, utilice una micropipeta para administrar 20 microlitros de ftalato de dibutilo o DBP, en el lado ventral del pinna del oído de un ratón transgénico Kaede anestesiado. Después de permitir que el DBP se seque, tire de la oreja a través de una hendidura en un pedazo de papel de aluminio y utilice cinta adhesiva de doble cara para fijar la oreja planamente a la lámina con el lado dorsal hacia arriba.
A continuación, coloque que está directamente debajo de una fuente de luz de 405 nanómetros y fotoconvierta durante tres minutos a 100 milivatios de potencia. Para la infección por vacunas, utilice una micropipeta para administrar 5 veces 10 a la 6a placa que forma unidades del virus de la vacuna en 10 microlitros de PBS en el pinna del oído de un ratón transgénico Kaede anestesiado y pinche el pinna 25 veces. 24 horas más tarde, photoconvertir el pinna como se acaba de demostrar.
En el punto de tiempo experimental apropiado, cosecha las pinnas y los ganglios linfáticos cervicales e inguinales y usa dos pares de pinzas para despegar el lado ventral y dorsal de cada pinna. A continuación, coloque los ganglios linfáticos y las piezas de pinna, con el interior de la oreja hacia abajo, en pozos individuales de una placa de 24 pozos que contiene 1 miligramo por mililitro de colágeno D y 80 unidades por mililitro de dnasa diluida en HBSS que contiene calcio y magnesio. Utilice dos agujas de calibre 29 para abrir cada cápsula del ganglio linfático y coloque la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Al final de la incubación, presione los tejidos de pinna y ganglios linfáticos digeridos a través de coladores separados de células de nylon de 70 micras para obtener suspensiones de una sola célula de cada tejido. Cuando los tumores hayan crecido al tamaño experimental adecuado, afeite cualquier piel recién regenerada alrededor del sitio del tumor y tire del tumor a través de un agujero circular cortado en un pedazo de papel de aluminio. Coloque el tumor directamente debajo de la fuente de luz de 405 nanómetros y fotoconvertir durante 5 minutos a 200 milivatios de potencia.
24 horas después de la fotoconversión, cosecha los tumores y ganglios linfáticos braquiales e inguinales de cada animal y usa tijeras para picar los tumores dentro de pozos individuales de una placa de 24 pozos que contiene Colágenoasa D y DNase en HBSS. Coloque los ganglios linfáticos en pozos separados y haga una burla para abrir las cápsulas como se acaba de demostrar. Después de incubar los tumores durante una hora y los ganglios linfáticos durante media hora a 37 grados Celsius, presione los tejidos digeridos a través de coladores separados de 70 micras para obtener suspensiones de una sola célula de cada tejido.
Para analizar las suspensiones de una sola célula por citometría de flujo, primero recoja el bazo o la sangre de un ratón transgénico Kaede y lyse los glóbulos rojos con tampón de potasio de cloruro de amonio. Divida las células en un Kaede FITC no convertido y una población de Kaede PE convertida y resuspendir las células Kaede PE de un solo color en un mililitro de PBS en un pozo de una placa de 24 pozos, luego fotoconvertir las células durante 5 minutos bajo una fuente de luz de 405 nanómetros a 100 milivatios de potencia. A continuación, utilice las celdas Kaede PE fotoconvertidas y las células Kaede FITC no convertidas para establecer los voltajes fotomultiplicadores en 70 a 80% del rango total de cada canal fluorescente.
Una vez que se hayan establecido los voltajes para las proteínas Kaede, compense todas las demás manchas de anticuerpos primarios utilizando cuentas de compensación etiquetadas con un solo fluoróforo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, ejecute las muestras en el citómetro de flujo de acuerdo con los protocolos de análisis citométrico de flujo estándar. Las suspensiones de una sola célula generadas a partir de la piel del oído o de los ganglios linfáticos drenantes cervicales inmediatamente después de la exposición a la fotoconversión revelan una eficiencia de conversión del 78% de todos los leucocitos positivos CD45 en la piel, sin que se observen células convertidas en los ganglios linfáticos drenantes.
La cuantificación del número de leucocitos positivos CD45 infiltrados en oídos fotoconvertidos cero y 24 horas después de la conversión, revela que la exposición a la luz violeta provoca un aumento estadísticamente significativo en la infiltración de leucocitos. Este aumento en la infiltración positiva de leucocitos CD45 sin embargo, es pequeño en relación con la infiltración inducida por un potente estímulo inflamatorio como el virus de la vacuna. La fotoconversión también aumenta la permeabilidad vascular en las pinnas del oído medida por el ensayo Miles, lo que en conjunto indica que se deben tener en cuenta los efectos de la luz violeta en la inflamación del tejido al optimizar la dosis, el tiempo de exposición y la interpretación de los datos.
El análisis citométrico de flujo de células tumorales disociadas de animales fotoconvertidos revela una conversión significativa de células positivas CD45 intratumorales de Kaede FITC positivas a Kaede PE positivas, mientras que las células de los ganglios linfáticos drenan permanecen sin convertir. La eficiencia de la fotoconversión de los leucocitos positivos CD45 varió significativamente entre los tipos y tamaños de tumores, con leucocitos positivos CD45 dentro de pequeños tumores de melanoma que demuestran la fotoconversión más eficiente. A medida que aumentan los volúmenes tumorales, la eficiencia de conversión disminuye a alrededor del 50%Notablemente, la melanina tiene un impacto sorprendente en la eficiencia de la fotoconversión con una máxima fotoconversión de células positivas CD45 observadas dentro de tumores productores de melanina de sólo alrededor del 30% en tumores más pequeños, que cae al 10% a medida que los volúmenes tumorales se acercan a 400 milímetros cúbicos.
El examen de los ganglios linfáticos drenantes tumorales 24 horas después de la fotoconversión revela la presencia de células inmunitarias positivas rojas Kaede de varios fenotipos, lo que demuestra la emigración de leucocitos del tumor fotoconvertido. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la Inmunología descubrieran la cinética del estado estacionario y la rotación de leucocitos inflamada en el tejido periférico. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que sólo el tejido de interés es fotoconvertido, ya que la fotoconversión involuntaria del tejido circundante comprometerá sus resultados.
Los individuos nuevos en este método deben optimizar el tiempo de exposición para la conversión de su tejido, así como la duración de los tiempos antes de que se produzca la recolección de tejido en función de la dinámica del leucocitos de interés.
