Este protocolo se centra en dos métodos de secado químico, Hexamethyldisilazane y alcohol T-butyl y su aplicación de imágenes de organismos procariotas y eucariotas utilizando SEM. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere el uso de equipos de secado especializados como un secador de punto crítico para preparar muestras para el análisis. Este protocolo describe los métodos para utilizar la deshidratación química y el análisis SEM de tres tipos de organismos, pero sería ampliamente aplicable al examen de muchos tipos de tejidos y organismos.
Demostrando el procedimiento estará Madison Koon, una estudiante de pregrado de mi laboratorio. Para empezar, preparar cianobacterias por fijación durante la noche. A continuación, transfiéralos a un equipo de filtración de 10 ml que contenga un filtro de policarbonato de 25 ml.
Selle el arma lateral y el embudo de la plataforma de filtración con tapones de goma para contener el cultivo en el embudo. Después de retirar ambos tapones, retire el fijador aspirando suavemente el matraz de filtración. Para preparar euglenoides de algas de una sola célula, fijelos añadiendo 3 gotas de 4%tetróxido de osmio directamente al cultivo que se ha transferido previamente a una plataforma de filtración de 10 ml.
Después de una incubación de 30 minutos, retire ambos tapones y retire el fijador al aspirar suavemente en el matraz de filtración. Lavar los euglenoides fijos tres veces con 5 ml de 0,1 M tampón de fosfato pH 7,0 a temperatura ambiente durante diez minutos cada uno manteniendo el matraz y el embudo cerrados con los tapones para sostener el lavado. Después de retirar ambos tapones, retire cada lavado al vacío suave en el matraz de filtración.
Para deshidratar la muestra mientras mantiene la inmersión continua, utilice una serie de etanols clasificados durante diez minutos en un volumen de 5 ml en el embudo mientras mantiene el matraz y el embudo cerrados con los tapones para contener el etanol en el embudo. Después de retirar ambos tapones, vacíe suavemente el matraz de filtración para eliminar el etanol. Transfiera la muestra a un plato de pesaje de aluminio desechable que contenga suficiente 100% de etanol para cubrir la muestra.
Para realizar el secado químico de los euglenoides utilizando TBA, primero reemplace la solución 100%etanol en el plato de aluminio con una solución de 1 a 1 de TBA y 100% etanol durante veinte minutos. A continuación, reemplace la solución 1 a 1 por 100% TBA durante veinte minutos y repita el proceso dos veces. Retire el TBA y sustitúyalo con el suficiente 100% TBA fresco para cubrir la muestra.
Coloque el plato a cuatro grados centígrados durante diez minutos para congelar la TBA. Transfiera la muestra a un desecador al vacío con envases de gel congelados para mantener la TBA congelada. Utilice una bomba rotativa para evacuar y mantener el vacío para permitir que la muestra se seque por sublimación al vacío del TBA congelado durante al menos tres horas.
Para montar cianobacterias en euglenoides, etiquete la parte inferior de un talón de montaje de aluminio de 25 mm para indicar lo que se está colocando en la parte superior. A continuación, coloque cada filtro en una pestaña adhesiva de carbono asegurada a la parte superior del talón. Para preparar Drosophila melanogaster, sumerja moscas anestesiadas en 1 ml de fijador durante dos horas a cuatro grados centígrados, asegurándose de que estén completamente sumergidas.
Utilice una pipeta de vidrio para quitar el fijador. Lavar la muestra fija de Drosophila en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml tres veces con 1 ml de tampón de fosfato de 0,1 M, pH 7,2 a temperatura ambiente durante diez minutos. Utilice una pipeta de vidrio para quitar cada lavado, teniendo cuidado de no retirar la muestra.
A continuación, deshidrate la muestra en un tubo de microfugo en un volumen de 1 ml utilizando una serie de etanols clasificados durante diez minutos cada uno. Utilice una pipeta de vidrio para quitar cada lavado, teniendo cuidado de no retirar la muestra. Conservar la muestra en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con suficiente 100% de etanol para cubrirla.
Para realizar el secado químico de las moscas utilizando HMDS, primero reemplace la solución 100% etanol con una solución de 1 a 2 de HMDS y 100% etanol durante veinte minutos. A continuación, reemplace la solución con una solución de 2 a 1 de HMDS y 100% de etanol durante veinte minutos. Por último, reemplace esta solución por 100%HMDS durante veinte minutos y repita el proceso una vez.
Transfiera la muestra que se encuentra en un tubo de micro centrífuga de 1,5 ml y HMDS en un plato de pesaje de aluminio desechable. Sustituya el 100% HMDS por el 100% HMDS 100% fresco para cubrir la muestra. Coloque la muestra dentro del plato de aluminio directamente en una campana química para secar con una tapa suelta, como una caja para evitar que los residuos caigan sobre la muestra y dejar que se seque durante 12 a 24 horas.
Para montar Drosophila, etiquete la parte inferior de un talón de montaje de aluminio. Utilice pinzas de precisión para colocar las moscas secas en la posición deseada en una pestaña adhesiva de carbono fijada a la parte superior de un talón bajo un microscopio de disección. Aplique adhesivo conductor de plata alrededor de los bordes exteriores de los talones.
Utilice un palillo de dientes para conectar la pintura plateada a las moscas, asegurando la conductividad, asegurándose de que la pintura no toque el área de imagen deseada. Coloque los talones en una caja de soporte de talón y, a continuación, coloque la caja de soporte de talón abierto en un desecador y deje que la pintura plateada se seque durante al menos tres horas. Para preparar el aparato de recubrimiento de pulverización, realice de 4 a 5 lavados de gas argón.
Dependiendo de las muestras que se van a recubrir, ajuste el temporizador a diferentes configuraciones como se describe en el manuscrito. Sputter recubrir los talones siguiendo las instrucciones del fabricante. Por último, muestras de imágenes utilizando un microscopio electrónico de barrido que incluye un detector de electrones secundario con ajustes que dependen de la muestra utilizada.
La preparación exitosa de cianobacterias para SEM utilizando este protocolo produjo imágenes donde los detalles de la célula, incluyendo la forma y textura de la superficie son visibles, así como una vaina de mucílago y proyecciones de las células. La imagen SEM de una especie filamentosa de agua dulce de Colorado muestra una vaina visible de mucílago. La imagen SEM de una bacteria de agua dulce de Ohio revela células individuales que a veces forman colonias unidas por una fina capa de mucílago.
Las protuberancias similares a filamentos se extienden desde las células individuales. Imágenes de especies filamentosas desconocidas de un estuario de alta salinidad en aguas costeras de Texas muestran células individuales y divisorias. SEM se utilizó para visualizar las tiras películos de dos especies diferentes de Euglenoid.
Al comparar Monomorphina y Aenigmatica con Monomorphina pseudo pyrum, la disposición helicoidal visible de las tiras de pellicle que emergen en el extremo posterior para formar una cola, ayuda en la filogenia a la terminación. Las imágenes SEM de ojos normales de drosophila muestran una matriz ordenada de cerdas y lentes, pero la expresión de proteínas asociadas con la enfermedad de Alzheimer crea el fenotipo ocular áspero. Los genes que suprimen o mejoran el fenotipo ocular áspero pueden desempeñar un papel fisiológico en la progresión de la enfermedad.
Estos son ejemplos de posibles caídas de fosas para evitar, incluyendo un ejemplo de la estructura colapsada del ojo de la técnica de secado incorrecto y la carga de electrones de la codificación insuficiente de pulverización que aparece durante la adquisición de la imagen. Los protocolos descritos aquí utilizaban organismos que muy con complicidad respetada, sin embargo, todos son susceptibles al análisis SEM para recopilar información útil y morfológica que es fundamental para los descubrimientos científicos que abarcan muchas subdisciplinas de la biología. No olvide que trabajar con alcohol T-Butyl, Hexamethyldisilazane y tetroxido de osmio puede ser peligroso y siempre deben observarse las medidas de seguridad adecuadas para proteger a los usuarios, especialmente a los estudiantes que van a manipular estos productos químicos.
