该协议侧重于两种化学干燥方法，六甲基二苯醚和T-丁基醇及其应用成像使用SEM的原核生物和真核生物。该技术的主要优点是，它不需要使用专门的干燥设备，如临界点干燥机来准备样品进行分析。该协议描述了使用化学脱水和SEM分析三种类型的生物体的方法，但将广泛适用于检查许多有机体和组织类型。
演示这个程序将是麦迪逊孔，一个本科生从我的实验室。首先，通过隔夜固定来准备蓝藻。然后，将它们转移到含有聚碳酸酯 25 mL 过滤器的 10 mL 过滤装置中。
用橡胶塞密封过滤装置的侧臂和漏斗，以遏制漏斗中的培养。拆下两个止动器后，通过轻轻吸尘过滤瓶来去除固定剂。要准备单细胞藻类，通过将3滴4%的三氧化二氮直接加入到之前被转移到10 mL过滤装置中的培养体中来修复它们。
经过30分钟的孵育，通过轻轻吸尘过滤瓶，拆下两个塞子并取出固定剂。在室温下用 5 mL 0.1 M 磷酸盐缓冲液 pH 7.0 清洗固定 euglenoid 三次，每次洗涤 10 分钟，同时用塞子关闭烧瓶和漏斗以进行清洗。拆下两个塞子后，通过过滤瓶上的温和真空去除每个洗涤液。
要使样品脱水，同时保持连续浸入状态，在漏斗中使用分级乙醇系列，在 5 mL 的体积内使用分级乙醇系列 10 分钟，同时保持烧瓶和漏斗与塞子关闭，以将乙醇控制在漏斗中。拆下两个塞子后，轻轻真空在过滤瓶上去除乙醇。将样品转移到一次性铝称重盘中，其中只含有足够 100%乙醇的样品。
要使用 TBA 对黄酮进行化学干燥，首先用 1 比 1 的 TBA 溶液和 100% 乙醇替换铝盘中的 1 比 1 乙醇溶液 20 分钟。然后，将 1 比 1 解决方案替换为 100%TBA 20 分钟，然后重复此过程两次。取出 TBA，并更换足够的新鲜 100%TBA 来覆盖样品。
将菜在四摄氏度下放置十分钟，以冷冻 TBA。将样品转移到真空干燥器中，并配有冷冻凝胶包，以保持 TBA 冷冻。使用旋转泵疏散和维护真空，使样品通过真空升华冷冻 TBA 干燥至少三个小时。
要将蓝藻安装在 euglenoid 中，请标记 25 mm 铝制安装存根的底部，以指示顶部放置的白化病菌。然后将每个过滤器放在固定在存根顶部的碳粘合卡舌上。为了准备果蝇黑色素，将麻醉苍蝇浸入1 mL的固定剂中，在4摄氏度下停留两小时，确保它们完全被淹没。
使用玻璃移液器拆下固定器。用1 mL 0.1 M磷酸盐缓冲液将固定的果蝇样品用1 mL 0.1 M磷酸盐缓冲液洗涤三次，在室温下将pH7.2洗涤10分钟。使用玻璃移液器去除每次洗涤，小心不要取出样品。
然后，使用分级乙醇系列将样品在1 mL的微混管中脱水1分钟。使用玻璃移液器去除每次洗涤，小心不要取出样品。将样品放在 1.5 mL 微离心管中，只需足够的 100% 乙醇覆盖它。
要使用 HMDS 对苍蝇进行化学干燥，首先用 1 到 2 的 HMDS 溶液和 100%乙醇溶液替换 100% 乙醇溶液 20 分钟。然后用 HMDS 的 2 比 1 溶液和 100%乙醇溶液更换溶液 20 分钟。最后，用 100%HMDS 替换此解决方案 20 分钟，然后重复此过程一次。
将 1.5 mL 微型离心管和 HMDS 中的样品转移到一次性铝称重盘中。将 100%HMDS 更换为足够新鲜 100%HMDS 以覆盖样品。将样品直接放在铝制烟罩中，用松动的盖子（如盒子）干燥，以防止碎屑落在样品上，并允许其干燥 12 至 24 小时。
要安装果蝇，请标记铝制安装存根的底部。使用精密钳子将干苍蝇放在解剖显微镜下固定在存根顶部的碳粘合卡上的所需位置。在存根的外边缘周围涂抹银导电胶。
使用牙签将银漆连接到苍蝇，确保导电性，确保油漆不会触及所需的成像区域。将存根放在存根支架盒中，然后将打开的存根支架盒放在干燥器中，让银漆干燥至少三个小时。要准备溅射涂层装置，请执行 4 到 5 次气冲。
根据要涂覆的样品，将计时器设置为手稿中描述的不同设置。溅射按照制造商的说明涂覆存根。最后，使用扫描电子显微镜进行图像采样，该显微镜包括一个二次电子探测器，其设置取决于所用样品。
利用该协议成功制备了SEM的蓝藻，在图像中可以看到细胞的细节，包括表面的形状和纹理，以及细胞的粘液和投影。来自科罗拉多的丝丝淡水物种的SEM图像显示了可见的粘液护套。来自俄亥俄州的淡水细菌的SEM图像揭示了单个细胞，这些细胞有时形成由薄薄的粘液层聚集在一起的菌落。
纤维样突起从单个细胞延伸。来自德克萨斯州沿海水域高盐度河口的未知丝质物种的图像显示了单个和分裂的细胞。SEM 用于可视化两种不同 Euglenoid 物种的皮条条。
当比较单态性，和Aenigmatica与单态性伪热，可见的卵条的可见侧向排列，出现在后端形成尾巴，有助于在植物性终止。正常果蝇眼的SEM图像显示有秩序的刷毛和镜片阵列，但与阿尔茨海默病相关的蛋白质的表达创造了粗糙的眼睛表型。抑制或增强粗糙眼表型的基因可能在疾病进展中起生理作用。
以下是要避免的潜在坑瀑布示例，包括由于干燥技术不当导致眼睛折叠结构的示例，以及图像采集过程中出现溅射编码不足导致电子充电的示例。这里描述的协议利用了非常受尊敬的共谋的生物体，但所有生物体都适合进行SEM分析，以收集有用的形态学信息，这些信息对于跨越生物学许多子学科的科学发现至关重要。不要忘记，使用 T-丁基醇、六甲基二甲苯和三氧化二氮可能很危险，应始终遵守适当的安全措施以保护用户，尤其是将处理这些化学品的学生。
