Dieses Protokoll konzentriert sich auf zwei chemische Trocknungsmethoden, Hexamethyldisilazan und T-Butylalkohol und deren Anwendung, die sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Organismen mit SEM abbilden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nicht den Einsatz spezieller Trocknungsanlagen wie eines kritischen Punkttrockners zur Vorbereitung von Proben für die Analyse erfordert. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Verwendung chemischer Dehydrierung und SEM-Analyse von drei Arten von Organismen, wäre aber im Großen und Ganzen auf die Untersuchung vieler Organismen- und Gewebetypen anwendbar.
Demonstriert wird das Verfahren von Madison Koon, einer Studentin aus meinem Labor. Zu Beginn, bereiten Cyanobakterien durch nächtliche Fixierung. Übertragen Sie sie dann in ein 10 ml Filtersystem, das einen 25 ml-Filter aus Polycarbonat enthält.
Versiegeln Sie den Seitenarm und Trichter des Filtergeräts mit Gummistopfen, um die Kultur im Trichter einzudämmen. Nach dem Entfernen beider Stopfen entfernen Sie das Fixativ durch sanftes Staubsaugen am Filterkolben. Um einzellige Algen-Euglenoide herzustellen, fixieren Sie sie, indem Sie 3 Tropfen 4%Osmium-Tetroxid direkt in die Kultur einfügen, die zuvor in ein 10 ml-Filtrationsgerät übertragen wurde.
Nach einer 30-minütigen Inkubation entfernen Sie beide Stopfen und entfernen Sie das Fixativ durch sanftes Staubsaugen am Filterkolben. Waschen Sie die festen Euglenoide dreimal mit 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 bei Raumtemperatur für jeweils zehn Minuten, während sie den Kolben und trichter mit den Stopfen geschlossen halten, um die Wäsche zu halten. Nach dem Entfernen beider Stopfen entfernen Sie jede Wäsche durch sanftes Vakuum am Filterkolben.
Um die Probe zu dehydrieren und dabei das kontinuierliche Eintauchen aufrechtzuerhalten, verwenden Sie eine abgestufte Ethanolserie für zehn Minuten in einem Volumen von 5 ml im Trichter, während Sie den Kolben und trichter mit den Stopfen geschlossen halten, um das Ethanol im Trichter zu enthalten. Nach dem Entfernen beider Stopfen staubt man sanft auf den Filtrationskolben, um Ethanol zu entfernen. Übertragen Sie die Probe auf eine Einweg-Aluminium-Wägeschale, die gerade genug 100% Ethanol enthält, um die Probe zu bedecken.
Um die chemische Trocknung der Euglenoide mit TBA durchzuführen, ersetzen Sie zunächst die 100%ethanol Lösung in der Aluminiumschale durch eine 1-zu 1-Lösung von TBA und 100%ethanol für zwanzig Minuten. Ersetzen Sie dann die 1-zu-1-Lösung für zwanzig Minuten durch 100%TBA, und wiederholen Sie den Vorgang zweimal. Entfernen Sie TBA und ersetzen Sie es mit gerade genug frischem 100%TBA, um die Probe abzudecken.
Legen Sie das Gericht bei vier Grad Celsius für zehn Minuten, um die TBA einfrieren. Übertragen Sie die Probe in einen Vakuum-Austrocknungsor mit gefrorenen Gelpackungen, um TBA gefroren zu halten. Verwenden Sie eine Drehpumpe, um Vakuum zu evakuieren und zu erhalten, damit die Probe durch Vakuumsublimation des gefrorenen TBA für mindestens drei Stunden trocknen kann.
Um Cyanobakterien in Euglenoiden zu montieren, beschriften Sie den Boden eines 25 mm Aluminium-Montagestummels, um anzuzeigen, was oben platziert wird. Legen Sie dann jeden Filter auf eine Carbon-Klebstoff-Lasche, die an der Oberseite des Stummels befestigt ist. Um Drosophila melanogaster vorzubereiten, tauchen Anästhesisierte Fliegen in 1 ml Fixativ für zwei Stunden bei vier Grad Celsius, um sicherzustellen, dass sie vollständig untergetaucht sind.
Verwenden Sie eine Glaspipette, um das Fixativ zu entfernen. Waschen Sie die feste Drosophila-Probe dreimal in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2 bei Raumtemperatur für zehn Minuten. Verwenden Sie eine Glaspipette, um jede Wäsche zu entfernen, wobei Sie darauf achten, die Probe nicht zu entfernen.
Anschließend dehydrieren Sie die Probe in einem Mikrofugenrohr in einem Volumen von 1 ml mit einer abgestuften Ethanolserie für jeweils zehn Minuten. Verwenden Sie eine Glaspipette, um jede Wäsche zu entfernen, wobei Sie darauf achten, die Probe nicht zu entfernen. Bewahren Sie die Probe in der 1,5 ml Mikrozentrifugenröhre mit gerade genug 100% Ethanol auf, um sie zu bedecken.
Um die chemische Trocknung der Fliegen mit HMDS durchzuführen, ersetzen Sie zunächst die 100%-Ethanol-Lösung für zwanzig Minuten durch eine 1-bis 2-Lösung von HMDS und 100%Ethanol. Dann ersetzen Sie die Lösung durch eine 2-1-Lösung von HMDS und 100%Ethanol für zwanzig Minuten. Schließlich ersetzen Sie diese Lösung durch 100%HMDS für zwanzig Minuten und wiederholen Sie dann den Vorgang einmal.
Übertragen Sie die Probe, die sich in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und HMDS befindet, in eine Einweg-Aluminium-Wägeschale. Ersetzen Sie das 100%HMDS durch gerade genug frische 100%HMDS, um die Probe abzudecken. Legen Sie die Probe in der Aluminiumschale direkt in eine chemische Rauchhaube, um sie mit einem losen Deckel wie einer Box zu trocknen, um zu verhindern, dass Schmutz auf die Probe fällt und sie 12 bis 24 Stunden trocknen kann.
Um Drosophila zu montieren, beschriften Sie den Boden eines Aluminium-Montagestummels. Verwenden Sie eine Präzisionspinzette, um die getrockneten Fliegen an der gewünschten Position auf einer Anklebenkundungslasche zu platzieren, die an der Oberseite eines Stubs unter einem Sezierendes Mikroskop befestigt ist. Tragen Sie silbernen leitfähigen Klebstoff um die äußeren Ränder der Stubs auf.
Verwenden Sie einen Zahnstocher, um die silberne Farbe mit den Fliegen zu verbinden, um die Leitfähigkeit zu gewährleisten und sicherzustellen, dass die Farbe nicht den gewünschten Bildbereich berührt. Legen Sie die Stuben in einen Stubhalterkasten, und legen Sie dann den offenen Stubhalterinin in einen Trockenbauund und lassen Sie die silberne Farbe mindestens drei Stunden trocknen. Um die Sputterbeschichtung stolvorzubereiten, führen Sie 4 bis 5 Spülungen argonengas.
Je nach zu beschichtenden Proben stellen Sie den Timer auf verschiedene Einstellungen ein, wie im Manuskript beschrieben. Sputter beschichten Sie die Stubs nach den Anweisungen des Herstellers. Schließlich Bildproben mit einem Rasterelektronenmikroskop, das einen sekundären Elektronendetektor mit Einstellungen enthält, die von der verwendeten Probe abhängen.
Die erfolgreiche Herstellung von Cyanobakterien für SEM mit diesem Protokoll ergab Bilder, bei denen Details der Zelle, einschließlich Form und Textur der Oberfläche, sowie eine Hülle aus Schleimhaut und Projektionen aus den Zellen sichtbar sind. Das SEM-Bild einer fadenförmigen Süßwasserart aus Colorado zeigt eine sichtbare Schleimscheide. Das SEM-Bild eines Süßwasserbakteriens aus Ohio zeigt einzelne Zellen, die manchmal Kolonien bilden, die durch eine dünne Schicht Von Schleim zusammengehalten werden.
Filamentartige Vorsprünge erstrecken sich von den einzelnen Zellen. Bilder unbekannter fadenförmiger Arten aus einer Hochsalzmündung in texanischen Küstengewässern zeigen einzelne und sich teilende Zellen. SEM wurde verwendet, um die Pellikelstreifen von zwei verschiedenen Euglenoid-Arten zu visualisieren.
Beim Vergleich von Monomorphina und Aenigmatica mit Monomorphina Pseudopyrum, der sichtbaren spiralförmigen Anordnung der Pelicle-Streifen, die am hinteren Ende entstehen, um einen Schwanz zu bilden, hilft die Phylogenie zur Beendigung. SEM-Bilder von normalen Drosophila-Augen zeigen eine geordnete Reihe von Borsten und Linsen, aber die Expression von Proteinen, die mit der Alzheimer-Krankheit assoziiert sind, erzeugen den groben Augenphänotyp. Gene, die den Grobaugen-Phänotyp unterdrücken oder verbessern, können eine physiologische Rolle bei der Fortschreiten der Krankheit spielen.
Hier sind Beispiele für mögliche Grubenstürze zu vermeiden, einschließlich eines Beispiels für die zusammengebrochene Struktur des Auges durch unsachgemäße Trocknungstechnik und Elektronenladung durch unzureichende Sputtercodierung, die während der Bildaufnahme erscheint. Die hier beschriebenen Protokolle nutzten Organismen, die sehr stark mit respektierter Komplizenschaft, aber alle sind für SEM-Analysen zugänglich, um nützliche, morphologische Informationen zu sammeln, die für wissenschaftliche Entdeckungen in vielen Teildisziplinen der Biologie entscheidend sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit T-Butylalkohol, Hexamethyldisilazan und Osmiumtetroxid gefährlich sein kann und die geeigneten Sicherheitsmaßnahmen sollten immer eingehalten werden, um Benutzer zu schützen, insbesondere Studenten, die mit diesen Chemikalien umgehen werden.
