Ce protocole se concentre sur deux méthodes de séchage chimique, l’alcool hexaméthyldisilazane et l’alcool de T-butyl et leur imagerie d’application des organismes procaryotes et eucaryotes utilisant SEM. Le principal avantage de cette technique est qu’elle n’exige pas l’utilisation d’équipement de séchage spécialisé tel qu’un séchoir à point critique pour préparer les échantillons aux fins d’analyse. Ce protocole décrit les méthodes d’utilisation de la déshydratation chimique et de l’analyse sem de trois types d’organismes, mais serait largement applicable à l’examen de nombreux types d’organismes et de tissus.
Madison Koon, étudiante de premier cycle de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer, préparez les cyanobactéries par fixation pendant la nuit. Ensuite, transférez-les dans une plate-forme de filtration de 10 mL contenant un filtre en polycarbonate de 25 mL.
Sceller l’arme latérale et l’entonnoir de la plate-forme de filtration avec des bouchons en caoutchouc pour contenir la culture dans l’entonnoir. Après avoir enlevé les deux bouchons, retirez le fixatif en aspirant doucement sur le flacon de filtration. Pour préparer les euglenoïdes d’algues unicellulaires, fixez-les en ajoutant 3 gouttes de tétroxide d’osmium de 4 % directement à la culture qui a déjà été transférée dans une plate-forme de filtration de 10 mL.
Après une incubation de 30 minutes, retirer les deux bouchons et retirer le fixatif en aspirant doucement sur le flacon de filtration. Lavez les euglenoïdes fixes trois fois avec 5 mL de 0,1 M de phosphate tampon pH 7,0 à température ambiante pendant dix minutes chacun tout en gardant le flacon et l’entonnoir fermés avec les bouchons pour tenir le lavage. Après avoir enlevé les deux bouchons, retirez chaque lavage par vide doux sur le flacon de filtration.
Pour déshydrater l’échantillon tout en maintenant une immersion continue, utilisez une série d’éthanol classé pendant dix minutes dans un volume de 5 mL dans l’entonnoir tout en gardant le flacon et l’entonnoir fermés avec les bouchons pour contenir l’éthanol dans l’entonnoir. Après avoir enlevé les deux bouchons passer l’aspirateur doucement sur le flacon de filtration pour enlever l’éthanol. Transférez l’échantillon dans un plat de pesage en aluminium jetable contenant juste assez d’éthanol à 100 % pour couvrir l’échantillon.
Pour effectuer le séchage chimique des euglenoïdes à l’aide de TBA, remplacez d’abord la solution 100% éthanol dans le plat en aluminium par une solution 1 à 1 de TBA et 100% éthanol pendant vingt minutes. Ensuite, remplacez la solution 1 à 1 par 100% TBA pendant vingt minutes et répétez le processus deux fois. Retirez TBA et remplacez par juste assez frais 100%TBA pour couvrir l’échantillon.
Placer le plat à quatre degrés Celsius pendant dix minutes pour congeler le TBA. Transférer l’échantillon dans un dessiccateur sous vide avec des paquets de gel congelés pour garder le TBA congelé. Utilisez une pompe rotative pour évacuer et maintenir le vide pour permettre à l’échantillon de sécher par sublimation sous vide de l’ABA congelée pendant au moins trois heures.
Pour monter des cyanobactéries dans les euglenoïdes, étiquetez le fond d’un talon de montage en aluminium de 25 mm pour indiquer ce qui est placé sur le dessus. Placez ensuite chaque filtre sur un onglet adhésif en carbone fixé au sommet du talon. Pour préparer Drosophila melanogaster, immerger les mouches anesthésiées dans 1 mL de fixatif pendant deux heures à quatre degrés Celsius, en s’assurant qu’elles sont complètement submergées.
Utilisez une pipette en verre pour enlever le fixatif. Lavez l’échantillon fixe de Drosophila dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL trois fois avec 1 mL de tampon phosphate de 0,1 M, pH 7,2 à température ambiante pendant dix minutes. Utilisez une pipette en verre pour enlever chaque lavage, en prenant soin de ne pas enlever l’échantillon.
Ensuite, déshydratez l’échantillon dans un tube de microfuge dans un volume de 1 mL à l’aide d’une série d’éthanol classé pendant dix minutes chacun. Utilisez une pipette en verre pour enlever chaque lavage, en prenant soin de ne pas enlever l’échantillon. Gardez l’échantillon dans le tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL avec juste assez d’éthanol à 100 % pour le couvrir.
Pour effectuer le séchage chimique des mouches à l’aide de SMDS, remplacez d’abord la solution 100% éthanol par une solution 1 à 2 de SMDS et 100% d’éthanol pendant vingt minutes. Remplacez ensuite la solution par une solution 2 à 1 de HMDS et 100% éthanol pendant vingt minutes. Enfin, remplacez cette solution par 100% HMDS pendant vingt minutes, puis répétez le processus une fois.
Transférer l’échantillon qui se trouve dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 mL et le SMDS dans un plat de pesage en aluminium jetable. Remplacez le 100%HMDS par juste assez frais 100%HMDS pour couvrir l’échantillon. Placez l’échantillon dans le plat en aluminium directement dans un capot de fumée chimique pour sécher avec un couvercle lâche comme une boîte pour empêcher les débris de tomber sur l’échantillon et laissez-le sécher pendant 12 à 24 heures.
Pour monter Drosophila, étiquetez le fond d’un talon de montage en aluminium. Utilisez des pinces de précision pour placer les mouches séchées dans la position désirée sur un onglet adhésif en carbone fixé au sommet d’un talon sous un microscope disséquant. Appliquez de l’adhésif conductrice argenté sur les bords extérieurs des talons.
Utilisez un cure-dent pour connecter la peinture argentée aux mouches, en assurant la conductivité, en vous assurant que la peinture ne touche pas la zone d’imagerie désirée. Placez les talons dans une boîte de support de talon, puis placez la boîte ouverte de support de talon dans un desiccator et laissez la peinture argentée sécher pendant au moins trois heures. Pour préparer l’appareil de revêtement de pulvérisateur, effectuer 4 à 5 bouffées de gaz argon.
Selon les échantillons à enduire, réglez la mise à jour en différents paramètres tels que décrits dans le manuscrit. Pulvériser le pelage des talons suivant les instructions des fabricants. Enfin, des échantillons d’image à l’aide d’un microscope électronique à balayage qui comprend un détecteur d’électrons secondaire avec des paramètres qui dépendent de l’échantillon utilisé.
La préparation réussie des cyanobactéries pour sem utilisant ce protocole a donné des images où les détails de la cellule, y compris la forme et la texture de la surface sont visibles aussi bien qu’une gaine de mucilage et des projections des cellules. L’image SEM d’une espèce filamenteuse d’eau douce du Colorado montre une gaine visible de mucilage. Sem image d’une bactérie d’eau douce de l’Ohio révèle des cellules individuelles qui forment parfois des colonies maintenues ensemble par une mince couche de mucilage.
Les saillies filamentaires s’étendent des cellules individuelles. Des images d’espèces filamenteuses inconnues provenant d’un estuaire à forte salinité dans les eaux côtières du Texas montrent des cellules individuelles et de division. Sem a été utilisé pour visualiser les bandes pellicle de deux espèces euglenoïdes différentes.
En comparant Monomorphina et Aenigmatica avec Monomorphina pseudo pyrum, l’arrangement hélitique visible des bandes pellicle qui émergent à l’extrémité postérieure pour former une queue, aide à la phylogénie à la terminaison. Les images SEM des yeux normaux de drosophile montrent une gamme ordonnée de poils et de lentilles mais l’expression des protéines associées à la maladie d’Alzheimer créent le phénotype rugueux d’oeil. Les gènes qui suppriment ou améliorent le phénotype oculaire rugueux peuvent jouer un rôle physiologique dans la progression de la maladie.
Voici des exemples de chutes de fosses potentielles à éviter, y compris un exemple de la structure effondrée de l’œil à partir d’une technique de séchage inadéquate et de la charge électronique à partir d’un codage pulvérisé insuffisant qui apparaît lors de l’acquisition de l’image. Les protocoles décrits ici utilisaient des organismes qui, avec une complicité très respectée, sont pourtant tous disponibles à l’analyse SEM pour recueillir des informations utiles et morphologiques qui sont essentielles pour les découvertes scientifiques couvrant de nombreuses sous-disciplines de la biologie. N’oubliez pas que le travail avec l’alcool T-Butyl, l’hexaméthyldisilazane et le tétoxyde d’osmium peut être dangereux et que les mesures de sécurité appropriées doivent toujours être observées pour protéger les utilisateurs, en particulier les étudiants qui manipuleront ces produits chimiques.
