このプロトコルは、2つの化学乾燥法、ヘキサメチルジシラザンとTブチルアルコールとSEMを使用して原核生物と真核生物の両方をイメージングするそれらのアプリケーションに焦点を当てています。この技術の主な利点は、分析用のサンプルを調製するために、臨界点乾燥機などの特殊な乾燥装置を使用する必要がなされないことです。このプロトコルは、3種類の生物の化学脱水およびSEM分析を使用する方法を記述するが、多くの生物および組織タイプを調べるのに広く適用されるであろう。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室の学部生であるマディソン・クーンです。開始するには、一晩固定することによってシアノバクテリアを調製します。次に、ポリカーボネート25mLフィルタを含む10mL濾過リグに移します。
ゴムストッパーでろ過リグのサイドアームと漏斗をシールして、漏斗の中の培養物を封じ込める。両方のストッパーを取り外した後、濾過フラスコに優しい掃除機をかけることによって固定剤を取り除きます。単細胞藻類のユーグレノイドを調製するには、4%オスミウム四酸化膜の3滴を、以前に10mL濾過リグに移された培養物に直接加えて固定します。
30分間のインキュベーションの後、両方のストッパーを取り外し、濾過フラスコに優しい掃除機をかけることによって固定剤を取り除きます。固定ユーグレノイドを0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.0の5 mLで10分間、フラスコと漏斗をストッパーで閉じて洗浄を保持したまま3回洗浄します。両方のストッパーを取り外した後、濾過フラスコ上の穏やかな真空によって各洗浄を除去する。
連続浸漬を維持しながらサンプルを脱水するには、フラスコと漏斗をストッパーで閉じたまま、漏斗中の5mLの体積で10分間のグレードエタノールシリーズを使用して、漏斗にエタノールを含めます。両方のストッパーを取り除いた後、濾過フラスコの真空を穏やかに除去し、エタノールを除去する。サンプルをサンプルをカバーするのに十分な100%エタノールを含む使い捨て可能なアルミニウム計量皿にサンプルを移します。
TBAを用いてユーグレノイドの化学乾燥を行う場合は、まずアルミニウム皿中の100%エタノール溶液をTBAの1~1溶液、100%エタノールに20分間交換します。その後、1~1溶液を100%TBAに20分間交換し、この処理を2回繰り返します。TBAを取り外し、サンプルをカバーするのに十分な新鮮な100%TBAと交換してください。
TBAを凍らせるには、10分間摂氏4度で皿を置きます。試料を冷凍ゲルパック付きの真空デシケーターに移し、TBAを凍結状態に保ちます。ロータリーポンプを使用して真空を排気し、維持し、凍結したTBAの真空昇華によってサンプルを少なくとも3時間乾燥させます。
ユーグレノイドにシアノバクテリアを取り付けるには、25mmのアルミニウム実装スタブの底にラベルを付けて、上に置かれているものを示します。次に、各フィルターをスタブの上部に固定したカーボン接着剤タブに置きます。ショウジョウバエメラノガスターを調製するには、麻酔付きハエを摂氏4度で2時間固定化して麻酔を行い、完全に水没していることを確認します。
ガラスピペットを使用して固定剤を取り除きます。固定ショウジョウバエサンプルを1.5 mLマイクロ遠心分離チューブで1.1Mリン酸緩衝液1 mL、pH 7.2を室温で10分間洗浄します。ガラスピペットを使用して各洗浄物を取り除き、サンプルを取り外さないと注意してください。
次いで、グレードエタノール系列をそれぞれ10分間用いて、マイクロフュージチューブ内のサンプルを1mLの体積で脱水する。ガラスピペットを使用して各洗浄物を取り除き、サンプルを取り外さないと注意してください。サンプルをカバーするのに十分な100%エタノールで1.5 mLマイクロ遠心チューブに保管してください。
HMDSを用いてハエの化学乾燥を行う場合は、まず100%エタノール溶液をHMDSの1~2溶液に、100%エタノールを20分間交換します。その後、溶液をHMDSの2~1溶液と100%エタノールで20分間交換します。最後に、このソリューションを100%HMDSに20分間交換してから、このプロセスを1回繰り返します。
1.5 mLマイクロ遠心分離チューブとHMDS内のサンプルを使い捨てアルミニウム計量皿に移します。サンプルをカバーするのに十分な新鮮な100%HMDSと100%HMDSを交換してください。アルミニウム皿の中に直接サンプルを化学発煙フードに入れ、箱などの緩い蓋で乾燥させ、破片がサンプルに落ちるのを防ぎ、12〜24時間乾燥させます。
ショウジョウバエを取り付けるには、アルミニウム製の取り付けスタブの底にラベルを付けます。精密ピンセットを使用して、乾燥したハエを、解剖顕微鏡の下でスタブの上部に固定されたカーボン接着タブの所望の位置に置きます。銀の導電性接着剤をスタブの外縁に貼ります。
爪楊枝を使って銀色の塗料をハエに接続し、導電性を確保し、塗料が目的のイメージング領域に触れないようにします。スタブをスタブホルダーボックスに入れ、開いたスタブホルダーボックスをデシケータに入れ、銀色の塗料を少なくとも3時間乾燥させます。スパッタ塗布装置を準備するために、アルゴンガスの4〜5フラッシュを行う。
コーティングするサンプルに応じて、原稿に記載されているようにタイマーを異なる設定に設定します。スパッタは、メーカーの指示に従ってスタブをコーティングします。最後に、使用するサンプルに依存する設定を持つ二次電子検出器を含む走査型電子顕微鏡を用いた画像サンプル。
このプロトコルを用いたSEM用シアノバクテリアの調製に成功し、表面の形状や質感を含む細胞の詳細、細胞からの粘液および突起の鞘が見える画像が得られた。コロラド州の糸状淡水種のSEM画像は、粘液の目に見える鞘を示しています。オハイオ州の淡水細菌のSEM画像は、時には粘液の薄い層によって一緒に保持されたコロニーを形成する個々の細胞を明らかにします。
フィラメント状突起は、個々の細胞から伸びる。テキサス州沿岸海域の高い堆積物からの未知の糸状種の画像は、個々の細胞と分裂細胞を示しています。SEMは、2つの異なるユーグレノイド種のペリクルストリップを視覚化するために使用された。
モノモルフィナとアイニグマティカをモノモルフィナ擬ピルムと比較すると、後端に出現するペリクルストリップの可視的なヘリカル配置が尾を形成し、フィロジナリを終結に補助する。正常なショウジョウバエの目のSEM画像は、剛毛とレンズの順序付けられた配列を示していますが、アルツハイマー病に関連するタンパク質の発現は、荒い目の表現型を作成します。眼の荒い表現型を抑制または増強する遺伝子は、疾患進行において生理学的役割を果たす可能性がある。
ここでは、不適切な乾燥技術から眼の崩壊した構造の例や、画像取得時に出現する不十分なスパッタコーディングからの電子帯電の例を含む、避けるべき潜在的なピットフォールの例を示す。ここで説明するプロトコルは、尊敬される共犯と非常に大きく使用される生物を利用しましたが、生物学の多くのサブ分野にまたがる科学的発見に不可欠な有用な形態学的情報を収集するためにSEM分析に適しています。T-ブチルアルコール、ヘキサメチルジシラザン、および四酸化オスミウムとの作業は危険であり、適切な安全対策は常にユーザー、特にこれらの化学物質を取り扱う学生を保護するために守られるべきであることを忘れないでください。
