Bu protokol iki kimyasal kurutma yöntemi, Hexamethyldisilazane ve T-butil alkol ve uygulama görüntüleme hem prokaryotik ve ökaryotik organizmalar SEM kullanarak odaklanır. Bu tekniğin en büyük avantajı, analiz için numune hazırlamak için kritik bir nokta kurutucu gibi özel kurutma ekipmanlarının kullanılmasını gerektirmemesidir. Bu protokol, üç tür organizmanın kimyasal dehidratasyon ve SEM analizini kullanma yöntemlerini açıklamaktadır, ancak birçok organizma ve doku tipinin incelenmesinde genel olarak uygulanabilir olacaktır.
Prosedürü gösteren Madison Koon, benim laboratuvarımdan bir lisans öğrencisi olacak. Başlamak için, gece fiksasyon tarafından siyanobakteriler hazırlamak. Daha sonra, polikarbonat 25 mL filtre içeren 10 mL filtrasyon teçhizatına aktarın.
Huni de kültürü içerecek şekilde lastik durdurucular ile filtrasyon teçhizatının yan kolunu ve hunini kapatın. Her iki stoper ikaldıktan sonra, filtrasyon şişesi üzerinde nazik vakumlama tarafından fiksatif kaldırın. Tek hücreli alg euglenoids hazırlamak için, daha önce 10 mL filtrasyon teçhizat içine transfer edilmiş kültürdoğrudan% 4 osmiyum tetroksit 3 damla ekleyerek bunları düzeltmek.
30 dakikalık bir kuluçkadan sonra, her iki stoperi çıkarın ve filtrasyon şişesinde hafif vakumlama ile fiksatifi çıkarın. Sabit euglenoidleri 5 mL 0,1 M fosfat tamponu pH 7.0 ile oda sıcaklığında on dakika boyunca yıkayın ve şişeyi stoperlerle birlikte kapalı tutun. Her iki stoper ikaldıktan sonra, filtrasyon şişesi üzerinde nazik vakum ile her yıkama çıkarın.
Sürekli daldırma korurken numuneyi susuz bırakmak için, hunide şişe ve huniyi kapalı tutarken hunide 5 mL'lik bir hacimde on dakika boyunca derecelendirilmiş bir etanol serisi kullanın. Her iki stoper çıkardıktan sonra hafifçe etanol kaldırmak için filtrasyon şişesi vakum. Numuneyi, numuneyi kapsayacak kadar %100 etanol içeren tek kullanımlık alüminyum tartı kabına aktarın.
TBA kullanarak euglenoids kimyasal kurutma gerçekleştirmek için, ilk yirmi dakika boyunca TBA 1-1 çözeltisi ve% 100 etanol ile alüminyum çanak% 100 etanol çözeltisi değiştirin. Daha sonra, 1'e 1 çözeltisini yirmi dakika boyunca %100 TBA ile değiştirin ve işlemi iki kez tekrarlayın. TBA'yı çıkarın ve numuneyi kaplayacak kadar taze %100 TBA ile değiştirin.
TBA dondurmak için on dakika boyunca dört derece santigrat çanak yerleştirin. TBA dondurulmuş tutmak için dondurulmuş jel paketleri ile bir vakum kurutucu için örnek aktarın. En az üç saat boyunca dondurulmuş TBA vakum süblimasyon tarafından örnek kurumasını sağlamak için tahliye ve vakum korumak için bir döner pompa kullanın.
Euglenoids siyanobakteriler monte etmek için, üstüne yerleştirilen ne olduğunu belirtmek için 25 mm alüminyum montaj saplama alt etiket. Daha sonra her filtreyi saplamanın üstüne sabitlenmiş bir karbon yapıştırıcı sekmesine yerleştirin. Drosophila melanogaster hazırlamak için, tamamen sular altında olduğundan emin olmak için, dört derece santigrat iki saat boyunca fiksatif 1 mL anestezi sinekler batırın.
Fiksatif kaldırmak için bir cam pipet kullanın. Sabit Drosophila örneğini 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte üç kez 0,1 M fosfat tamponu, pH 7,2'yi oda sıcaklığında on dakika yıkayın. Her yıkama kaldırmak için cam bir pipet kullanın, örnek kaldırmak için dikkatli olmak.
Daha sonra, her biri on dakika boyunca dereceli bir etanol serisi kullanarak 1 mL hacimde bir mikrofuge tüp örnek dehydrate. Her yıkama kaldırmak için cam bir pipet kullanın, örnek kaldırmak için dikkatli olmak. Numuneyi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte ,%100 etanolle kaplayacak kadar saklayın.
HMDS kullanarak sineklerin kimyasal kurumasını gerçekleştirmek için, ilk olarak %100 etanol çözeltisini 20 dakika boyunca 1-2 HMDS çözeltisi ve %100 etanol ile değiştirin. Daha sonra çözeltiyi 2-1 hmds çözeltisi ve %100 etanol ile yirmi dakika değiştirin. Son olarak, bu çözümü yirmi dakika boyunca %100 HMDS ile değiştirin ve işlemi bir kez tekrarlayın.
1,5 mL mikro santrifüj tüp ve HMDS'deki numuneyi tek kullanımlık alüminyum tartı kabına aktarın. 100%HMDS'yi numuneyi kaplayacak kadar taze %100 HMDS ile değiştirin. Numunenin üzerine düşmesini önlemek için bir kutu gibi gevşek bir kapakla kuruması için numuneyi doğrudan kimyasal bir duman kaputuna yerleştirin ve 12 ila 24 saat kurumasını bekleyin.
Drosophila monte etmek için, bir alüminyum montaj saplama alt etiket. Kurutulmuş sinekleri, bir kesme mikroskobu altında sapının üstüne sabitlenmiş karbon yapışkan sekmesine istenilen konuma yerleştirmek için hassas cımbız kullanın. Saplamaların dış kenarlarına gümüş iletken yapıştırıcı uygulayın.
Gümüş boyayı sineklere bağlamak için kürdan kullanın, iletkenliği sağlayarak boyanın istenilen görüntüleme alanına dokunmamasını sağlar. Saplamalarbir saplama tutucu kutusuna yerleştirin ve sonra açık saplama tutucu kutusunu bir kurutucuya yerleştirin ve gümüş boyanın en az üç saat kurumasını bekleyin. Püskürtme kaplama aparatı hazırlamak için, argon gazı 4-5 floş gerçekleştirin.
Kaplanacak örneklere bağlı olarak, zamanlayıcıyı el yazmasında açıklandığı gibi farklı ayarlara ayarlayın. Sputter, üreticilerin talimatlarına uyarak saplamalara kat. Son olarak, kullanılan örneğe bağlı ayarlara sahip ikincil bir elektron dedektörü içeren taramalı elektron mikroskobu kullanan görüntü örnekleri.
Bu protokol kullanarak SEM için siyanobakterilerin başarılı bir şekilde hazırlanması, hücrenin şekli ve dokusu nun yanı sıra hücrelerden gelen bir klik ve projeksiyonların da görülebildiği görüntüler ortaya çıkar. Colorado bir ipliksi tatlı su türlerinin SEM görüntü zamk görünür bir kılıf gösterir. Ohio bir tatlı su bakterileri SEM görüntü bazen zamm ince bir tabaka tarafından bir arada tutulan koloniler oluşturan bireysel hücreleri ortaya koymaktadır.
Filament benzeri çıkıntılar tek tek hücrelerden uzanır. Teksas kıyı sularında yüksek tuzluluk haliç bilinmeyen ipliksi türlerin görüntüleri bireysel ve bölen hücreleri göstermektedir. SEM iki farklı Euglenoid türünün pellicle şeritler görselleştirmek için kullanılmıştır.
Monomorfin ve Aenigmatica monomorfin psödo pirum ile karşılaştırırken, bir kuyruk oluşturmak için arka ucunda ortaya pellicle şeritler görünür sarmal düzenleme, sonlandırma kliojen yardım. Normal drosophila gözlerin SEM görüntüleri kıllar ve lensler in sıralı bir dizi göstermek ama Alzheimer hastalığı ile ilişkili proteinlerin ekspresyonu kaba göz fenotip oluşturmak. Kaba göz fenotipini bastıran veya geliştiren genler hastalığın ilerlemesinde fizyolojik bir rol oynayabilir.
Aşağıda, yanlış kuruma tekniğinden gözün çökmüş yapısıve görüntü edinimi sırasında ortaya çıkan yetersiz püskürtme kodlamasından elektron şarj ı da dahil olmak üzere, kaçınılması gereken potansiyel çukur düşme örnekleri verilmiştir. Burada açıklanan protokoller, çok büyük ölçüde saygın suç ile organizmalar kullanılan, henüz tüm biyoloji birçok alt disiplinleri kapsayan bilimsel keşifler için kritik yararlı, morfolojik bilgi toplamak için SEM analizi için münasip vardır. T-Butyl alkol, Hexamethyldisilazane ve osmium tetroksit ile çalışan tehlikeli olabilir ve uygun güvenlik önlemleri her zaman kullanıcıları korumak için gözlenen gerektiğini unutmayın, özellikle bu kimyasallar ele olacak öğrenciler.
