Обмен регионами структурно похожих белков для создания кимер позволяет исследовать важность регионов, ответственных за биологические функции молекулы, которые будут изучены. Регион обменов predoff общей вторичной структуры белка, так что регион важно для его общей структуры можно отличить от тех, непосредственно посредничество биологических функций. Он может превратиться в выбранный, какие именно регионы должны быть заменены.
Начиная с больших обменов, как правило, полезно определить ключевую функциональность белка. Чтобы начать процедуру, выберите подходящий белок в качестве донора для обмена регионами с интересом белка, как описано в текстовом протоколе. Затем получите белковые аминокислотные последовательности реципиента и донорских белков из базы данных эталонной последовательности, сначала получить доступ к разделу генов на веб-странице ref seq.
Ввените название белка, представляющих интерес в поле поиска и нажмите поиска. Нажмите на название гена для желаемого вида в результирующем списке. Прокрутите вниз к разделу ref seq, чтобы увидеть все документированные изоформы.
Нажмите на идентификатор последовательности для изоформы интереса. Прокрутите вниз и нажмите на компакт-диски, чтобы выделить область кодирования белка гена. В правом нижнем углу экрана нажмите на FAFSDA и скопировать генную последовательность.
Сохраните последовательность ДНК с помощью подходящего программного обеспечения для редактирования ДНК. При использовании свободно доступного APE откройте программу, вставьте скопированную последовательность в пустой ящик, выберите имя последовательности и нажмите сохранить. Теперь выберите белковые области, которые будут заменены в различных кимерических конструкциях, сначала разделив белковую последовательность интересов в различных структурных регионах.
Для этого загрузите структурные данные о заинтересованности белка с веб-сайта PDBe. Доступ к странице PDBe для белка и скачать файл PDBe, нажав скачать на правой стороне экрана. Откройте файл PDBe в молекулярной системе визуализации, как Pymol.
В Pymol отобразить нуклеотидную последовательность, скрыть структурные данные по умолчанию и выбрать вид мультфильма, чтобы четко визуализировать структурные особенности белка. Нажмите на нуклеотидную последовательность в верхней части экрана, чтобы выделить различные части молекулы, упомяая аминокислоты, соответствующие каждой отличительной структурной особенности. Теперь аннотировать различные структурные области на последовательности ДНК в APE, открыв последовательность ДНК, выбрав его, и нажав ORFs перевести, а затем нажмите на последнюю аминокислоту первой области, чтобы подчеркнуть свое положение в последовательности ДНК и выбрать нуклеотид кодирования для этой области.
Нажмите правой кнопкой мыши на выбор и выберите новую функцию, чтобы придать ему имя и цвет. Повторите процесс для каждого структурного региона, выявленный на предыдущем этапе. Чтобы выровнять последовательности остатков двух белков, во-первых, получить полную аминокислоту последовательности доноров и рецепторов белков в APE.
Как и прежде, откройте последовательность ДНК донора, выберите ее и нажмите ORFs перевод. Затем, доступ к веб-странице Clustal Omega, а затем положить аминокислоты последовательности двух белков. Каждая последовательность должна быть продолжена текстовой строкой с именем белка, которое должно быть правильно идентифицировано.
Прокрутите вниз и нажмите отправить. Извлеките файл выравнивания, нажав на вкладку файла выравнивания загрузки и сохраните его. Этот файл может быть открыт любой программой редактирования текста.
Используя файл выравнивания в качестве эталона, аннотировать соответствующие структурные области донорского белка в их последовательности ДНК. Создайте копию аннотированной последовательности ДНК рецепторного белка и переименуйте его в кимерический белок. Откройте переименованную последовательность ДНК в APE.
Выберите область для обмена в донорском белке, а затем выберите соответствующую область в переименованном рецепторном белке. Вставьте донорский белок последовательности ДНК, а затем сохранить изменения. Дизайн терминальных праймеров с использованием редактора ДНК, таких как APE.
Создайте новый файл ДНК, инициировать конец терминала грунтовка с лидером последовательности. Затем первый сайт ограничения, выбранный в векторах MCS, и дополнительный промеец в начальных 18-27 базовых парах гена интереса. В новом файле ДНК, дизайн C терминала грунтовка последовательности, чтобы начать с окончательными 18 до 27 базовых пар гена интереса следуют дополнительный спейсер, второй сайт ограничения выбран, и последовательность лидеров.
Выделите всю последовательность, правый щелчок, и выберите обратный комплимент, чтобы получить обратный грунтовка. Теперь, дизайн грунтовки для каждого из пограничных районов в кимерических конструкций. В последовательности ДНК кимеры выделите область 30 базовых пар в зоне контакта исходных и вставленных последовательностей.
Это состоит из 15 базовых пар в каждой последовательности. Скопируйте область и вставьте ее в новый файл ДНК. Эта последовательность будет вперед грунтовка.
Сделайте копию перемотка вперед, сгенерированную на предыдущем этапе, и переименуйте ее в обратную грунтовку. Выделите последовательность грунтовок, нажмите правой кнопкой мыши и выберите обратный комплимент для создания обратной последовательности грунтовок. Повторите эти шаги для каждой контактной зоны в последовательности кимерической ДНК.
Как правило, для генерации одной кимеры требуется два набора форвардных реверсных грунтовок, если только замена не происходит в терминалах N или C. Подготовьте индивидуальную смесь реакции ПЦР для каждого из фрагментов, сочиняющих кимерический белок. Сначала установите одну точку пятимилаторной микрофузной трубки на льду и заведите различные реагенты смесей ПЦР в порядке, перечисленном в текстовом протоколе.
Убедитесь, что для каждой реакции ПЦР используются правильные грунтовки и шаблоны. Этикетка две тонкие стеной нулевой точки два миллиметра ПЦР труб для каждой реакции и передачи 20 микролитров соответствующей смеси ПЦР в каждой трубке. Перенесите трубки ПЦР в термоциклер ПЦР и инициатор протокола, как описано в текстовом протоколе.
После завершения реакции ПЦР добавьте в каждую трубку четыре микролитров буфера загрузки ДНК по шесть х. Вставьте один процент агаросс гель в блок электрофорез и крышка с буфером TAE. Тщательно загрузите образцы в гель вместе с молекулярным весом последнего.
После запуска геля на 80 до 120 вольт в течение 20 до 45 минут, выключите блок электрофорез и удалить агоросс гель. Визуализуя усиленные полосы ДНК под ультрафиолетовым светом. Используя лезвие бритвы, вырежьте отдельные фрагменты ДНК из геля и перенесите их в помеченные две миллилтерные микрофузыки.
После использования комплекта очистки ПЦР для очистки фрагментов ДНК, количественно количество ДНК восстановлено путем измерения поглощения образцов на 260 нанометров и 340 нанометров в спектрофетометре. Теперь выполните усиление ПЦР для генерации последовательности кимерической ДНК. Во-первых, настроить 50 микролитров реакции ПЦР, чтобы сплавить отдельные компоненты кимеры, как и раньше.
Найди праймеры терминала N и C вместе с 10 нанограммами каждого из усиленных фрагментов ДНК. Восстановление и количественная оценка очищенного фрагмента ДНК, как и прежде, в 30 микролитров ядра свободной воды. Этот фрагмент содержит кимерическую последовательность ДНК, окруженную местами ограничения, включенными в праймеры терминала.
Поколение кимерического белка является примером с двумя членами меж лук и шесть семейство ситокин. Онкостейн М при ингибиторном факторе лейкемии. OSM лифт кимера результаты обмена до н.э. цикл области OSM с соответствующей последовательности подъема.
Первый этап усиления ПЦР состоял из трех отдельных реакций. N-терминал OSM фрагмент, который требует N-терминал OSM вперед и до н.э. начать обратный грунтовки использовали OSM в качестве шаблона. Цикл LIF BC был получен через BC start forward и BC N обратные грунтовки с использованием LIF в качестве шаблона.
Фрагмент C-терминала OSM использовал в качестве шаблона конечные вперед и C-терминал OSM реверсивные грунтовки, а также OSM. Эти очищенные фрагменты затем были использованы в качестве шаблона во второй реакции ПЦР вместе с N-терминальной OSM вперед и C-терминал OSM обратные грунтовки для усиления соответствующей последовательности гена osM LIF BC цикла. После очистки и превращения в электронную палочку, отдельные плазмиды были изолированы и проверены путем ограничения пищеварения фермента для правильной вставки фрагмента ДНК.
Гель электрофорез показал положительные хиты, которые затем были отправлены для проверки последовательности. Кимерические белки должны быть произведены и активность измеряется в идеальной системы фракционности. Для определения важности замененных регионов для этой конкретной фракции.
Этот метод был очень полезным и часто применяется, вмешался сигнальных рецепторов для того, чтобы определить ключевые области функции и сайты распознавания рецепторов. Номер, который я использую для электрофореза ДНК, должен обрабатываться с помощью одноразовых перчаток, лабораторного пальто и защитных очков.
