키머라를 만들기 위해 구조적으로 유사한 단백질의 영역을 교환하면 분자의 생물학적 기능에 대한 책임이있는 영역의 중요성을 연구 할 수 있습니다. 지역 교류는 단백질의 일반적인 이차 구조를 프레도오프하여 전체적인 구조에 대한 지역중요성으로 생물학적 기능을 직접 중재하는 것과 구별될 수 있습니다. 교체할 정확한 영역을 선택으로 전환할 수 있습니다.
더 큰 교류로 시작하는 것은 일반적으로 단백질의 주요 기능을 확인하는 데 도움이됩니다. 절차를 시작하려면, 텍스트 프로토콜에 상세한 바와 같이 관심의 단백질과 영역을 교환하는 기증자로서 적합한 단백질을 선택합니다. 이어서, 참조 서열 데이터베이스로부터 수신자 및 기증자 단백질의 단백질 아미노산 서열을 먼저 참조 세크 웹페이지에서 유전자 섹션에 접근시킴으로써 얻을 수 있다.
검색 상자에 관심 있는 단백질의 이름을 입력하고 검색을 클릭합니다. 결과 목록에서 원하는 종에 대한 유전자 이름을 클릭합니다. 참조 seq 섹션으로 스크롤하여 문서화된 모든 등소 양식을 확인합니다.
관심 있는 등소형식에 대한 시퀀스 식별자를 클릭합니다. 아래로 스크롤하여 CD를 클릭하여 유전자의 단백질 코딩 영역을 강조합니다. 화면 오른쪽 하단에서 FAFSDA를 클릭하고 유전자 서열을 복사합니다.
적합한 DNA 편집 소프트웨어를 사용하여 DNA 서열을 저장합니다. 자유롭게 사용할 수 있는 APE를 사용하는 경우 프로그램을 열고 복사된 시퀀스를 빈 상자에 붙여 넣은 다음 시퀀스 이름을 선택하고 저장을 클릭합니다. 지금, 다른 기메라 구조에서 대체되는 단백질 영역을 선택하여 먼저 뚜렷한 구조 영역에서 관심의 단백질 서열을 분할한다.
이렇게 하려면 PDBe 웹 사이트에서 관심 있는 단백질의 구조 데이터를 다운로드하십시오. PDBe 페이지에 액세스하여 단백질에 액세스하고 화면 의 오른쪽에서 다운로드를 클릭하여 PDBe 파일을 다운로드합니다. Pymol과 같은 분자 시각화 시스템에서 PDBe 파일을 엽니다.
Pymol에서, 뉴클레오티드 서열을 표시하고, 기본 구조 데이터를 숨기고, 단백질의 구조적 특징을 명확하게 시각화하기 위해 만화 뷰를 선택한다. 각 독특한 구조 적 특징에 대응하는 아미노산을 지적, 분자의 다른 부분을 강조하기 위해 화면의 상단에 뉴클레오티드 서열을 클릭합니다. 지금, APE에서 DNA 서열에 뚜렷한 구조 영역을 인음하여 DNA 서열을 열고, 그것을 선택하고, ORF를 클릭한 다음, DNA 서열에서의 위치를 강조하기 위해 첫 번째 영역의 마지막 아미노산을 클릭하고 그 지역에 대한 뉴클레오티드의 코딩을 선택한다.
선택을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이름과 색상을 제공하기 위해 새 기능을 선택합니다. 이전 단계에서 식별된 각 구조 영역에 대한 프로세스를 반복합니다. 두 단백질의 잔류체 서열을 맞추기 위해 먼저 APE에서 기증자 및 수용체 단백질의 전체 아미노산 서열을 얻습니다.
이전과 마찬가지로 기증자 DNA 서열을 열고 선택하여 ORF를 클릭하여 변환합니다. 그런 다음, Clustal 오메가 웹 페이지에 액세스 한 다음 두 단백질의 아미노산 서열을 넣습니다. 각 서열은 단백질 이름이 있는 텍스트 줄에 의해 제대로 식별되어야 합니다.
아래로 스크롤하여 제출을 클릭합니다. 다운로드 정렬 파일 탭을 클릭하여 정렬 파일을 검색하고 저장합니다. 이 파일은 모든 텍스트 편집 프로그램에서 열 수 있습니다.
정렬 파일을 참고로 사용하여, 그들의 DNA 서열에서 기증자 단백질의 해당 구조 영역에 인가한다. 수용체 단백질의 부가 된 DNA 서열의 사본을 만들고 기메라 단백질로 이름을 바꿉니다. APE에서 이름이 변경된 DNA 서열을 엽니다.
기증자 단백질에서 교환되는 영역을 선택한 다음 이름이 변경된 수용체 단백질에서 해당 영역을 선택합니다. 기증자 단백질 DNA 서열을 붙여 넣은 다음 변화를 저장합니다. APE와 같은 DNA 편집기를 사용하여 터미널 프라이머를 설계합니다.
새 DNA 파일을 만들고, 리더 시퀀스를 사용하여 최종 단말 프라이머를 시작합니다. 벡터 MCS 및 관심 유전자의 초기 18 에서 27 염기 쌍에서 선택적 스페이서에서 선택된 첫 번째 제한 부위가 뒤따릅니다. 새로운 DNA 파일에서, C 단말 프라이머 서열을 설계하여 관심 유전자의 최종 18~27기 쌍으로 시작하여 선택적 스페이서, 선택된 제2 제한 부위 및 지도자 서열이 뒤따릅니다.
전체 시퀀스를 강조 표시하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 역방향 칭찬을 선택하여 역프라이머를 가져옵니다. 이제 키메라 구문에서 각 테두리 영역에 대한 프라이머를 디자인합니다. 키모라의 DNA 서열에서, 원래 및 삽입된 서열이 접촉되는 영역에서 30개의 염기 쌍 영역을 강조한다.
이는 각 시퀀스에서 15개의 베이스 쌍으로 구성됩니다. 영역을 복사하여 새 DNA 파일에 붙여 넣습니다. 이 시퀀스는 앞으로 프라이머가 됩니다.
이전 단계에서 생성된 포워드 프라이머의 복사본을 만들고 역계 프라이머로 이름을 바꿉니다. 프라이머 시퀀스를 강조 표시하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 역방향 칭찬을 선택하여 역프라이머 시퀀스를 생성합니다. 기황 DNA 서열의 각 접촉 영역에 대해 이러한 단계를 반복한다.
일반적으로 N 단말 또는 C 단말 영역에서 교체가 발생하지 않는 한 두 세트의 전방 역 프라이머가 하나의 키메라를 생성해야 한다. 기메라 단백질을 구성하는 각 단편에 대해 개별 PCR 반응 혼합물을 준비한다. 먼저 얼음에 1점 5 밀리터 마이크로퓨즈 튜브를 설정하고 텍스트 프로토콜에 나열된 순서로 PCR 혼합물의 상이한 시약을 피펫한다.
각 PCR 반응에 대해 올바른 프라이머와 템플릿이 사용되도록 합니다. 각 반응에 대해 두 개의 얇은 벽제로 0점 2개의 밀리리터 PCR 튜브를 라벨로 지정하고 각 튜브에 해당 PCR 혼합물의 20 마이크로리터를 이송한다. PCR 튜브를 PCR 열순환기로 전송하고 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 프로토콜을 시작합니다.
PCR 반응이 완료된 후 각 튜브에 6x DNA 로딩 버퍼의 4개의 마이크로리터를 추가합니다. 1% 아가로스 젤을 전기전도 장치에 삽입하고 TAE 버퍼로 덮습니다. 조심스럽게 분자량 후자와 함께 젤에 샘플을로드합니다.
겔을 80~ 120볼트에서 20~45분 동안 실행한 후, 전기전도 장치를 끄고 아고로스 젤을 제거한다. 자외선 아래에서 증폭된 DNA 밴드를 시각화합니다. 면도날을 사용하여 젤에서 개별 DNA 조각을 잘라 내어 두 개의 밀리터 리터 마이크로 퓨즈 튜브에 라벨을 부착합니다.
PCR 정리 키트를 사용하여 DNA 단편을 정화한 후 분광계에서 260나노미터 및 340 나노미터에서 샘플의 흡광도를 측정하여 회수된 DNA의 양을 정량화합니다. 지금, 키메라 DNA 서열을 생성하기 위해 PCR 증폭을 수행한다. 먼저, 이전과 같이 키미라의 분리성분을 융합하기 위해 PCR 반응의 50마이크로리터를 설정한다.
증폭된 각 DNA 단편의 10나노그램과 함께 N 단자 및 C 단말 프라이머를 채용한다. 핵 자유 물의 30 마이크로 리터에서, 이전과 같이 정제 된 DNA 조각을 복구하고 정량화. 이 단편은 단말 프라이머에 포함된 제한 부위에 의해 측면에 있는 기홍 DNA 서열을 포함한다.
기메라 단백질의 생성은 인터 루크와 여섯 sytokine 가족의 두 구성원으로 예시된다. 백혈병 억제 인자에서 Oncostaten M. OSM 리프트 키모라는 OSM의 BC 루프 영역을 해당 리프트 시퀀스와 교환한 결과입니다.
첫 번째 PCR 증폭 단계는 세 개의 별도 반응으로 구성되었습니다. N 단자 OSM 앞으로 및 BC 시작 역 프라이머가 필요 N 단말 OSM 조각은 템플릿으로 OSM을 사용했다. LIF BC 루프는 BC 시작을 통해 얻어졌고, BC N은 LIF를 템플릿으로 사용하여 프라이머를 역전시켰다.
C-터미널 OSM 조각은 BC 엔드 포워드와 C 단말 OSM 역 프라이머뿐만 아니라 OSM을 템플릿으로 사용했습니다. 이러한 정제된 단편은 해당 OSM LIF BC 루프 유전자 서열을 증폭시키기 위해 N단 OSM 포워드 및 C 단말 OSM 역프라이머와 함께 제2 PCR 반응에서 템플릿으로 사용하였다. e-coli로 정화 및 변환에 따라, 개별 플라스미드는 DNA 단편의 적절한 삽입을 위한 제한 효소 소화에 의해 격리되고 검열되었다.
겔 전기 전도는 다음 시퀀스 검증을 위해 전송 된 긍정적 인 안타를 공개했다. 키메라 단백질은 생성되어야 하며 완벽한 파벌 시스템에서 측정된 활성이 있어야 합니다. 특정 진영에 대해 대체 된 영역의 중요성을 결정하기 위해.
이 기술은 주요 기능 도메인 및 수용체 인식 사이트를 식별하기 위해 신호 수용체를 방해하는 매우 유용하고 자주 적용되었습니다. DNA 전기 전광에 사용하는 숫자는 일회용 장갑, 실험실 코트 및 보호 안경을 사용하여 처리해야합니다.
