Lo scambio di regioni di proteine strutturalmente simili per creare kimeras ci permette di indagare l'importanza delle regioni responsabili delle funzioni biologiche della molecola da studiare. Gli scambi di regioni predoff la struttura secondaria generale della proteina in modo che la regione sia importante per la sua struttura generale possono essere distinti da quelli che mediano direttamente le funzioni biologiche. Può trasformarsi in selezionare quali regioni esatte sostituire.
Iniziare con scambi più grandi è di solito utile per identificare la funzionalità chiave della proteina. Per iniziare la procedura, selezionare una proteina adatta come donatore per scambiare regioni con la proteina di interesse come descritto nel protocollo di testo. Quindi, ottenere le sequenze di amminoacidi proteici delle proteine riceventi e donatrici dal database della sequenza di riferimento accedendo prima alla sezione genica nella pagina web ref seq.
Digitare il nome della proteina di interesse nella casella di ricerca e fare clic su cerca. Clicca sul nome del gene per le specie desiderate nell'elenco risultante. Scorrere verso il basso fino alla sezione ref seq per visualizzare tutti gli isoformi documentati.
Fare clic sull'identificatore di sequenza per l'isoforma di interesse. Scorrere verso il basso e fare clic sui cd per evidenziare la regione di codifica proteica del gene. In basso a destra dello schermo, fare clic su FAFSDA e copiare la sequenza genica.
Salvare la sequenza di DNA utilizzando un software di editing del DNA adatto. Quando si utilizza l'APE liberamente disponibile, aprire il programma, incollare la sequenza copiata nella casella vuota, selezionare il nome della sequenza e fare clic su Salva. Ora, scegliete le regioni proteiche da sostituire nei diversi costrutti kimerici dividendo prima la sequenza proteica di interesse in distinte regioni strutturali.
Per fare ciò, scarica i dati strutturali della proteina di interesse dal sito web di PDBe. Accedere alla pagina PDBe per la proteina e scaricare il file PDBe facendo clic su scarica sul lato destro dello schermo. Aprite il file PDBe in un sistema di visualizzazione molecolare, come Pymol.
In Pymol, visualizzate la sequenza nucleotidica, nascondete i dati strutturali predefiniti e selezionate la vista cartone animato per visualizzare chiaramente le caratteristiche strutturali della proteina. Fare clic sulla sequenza nucleotidica nella parte superiore dello schermo per evidenziare diverse parti della molecola, notando gli amminoacidi corrispondenti a ciascuna caratteristica strutturale distintiva. Ora, annotare le distinte regioni strutturali sulla sequenza di DNA in APE aprendo la sequenza di DNA, selezionandola e facendo clic su ORF tradotti, quindi fare clic sull'ultimo amminoacido della prima regione per evidenziare la sua posizione nella sequenza del DNA e selezionare la codifica del nucleotide per quella regione.
Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla selezione e selezionare una nuova funzione per assegnarle un nome e un colore. Ripetere il processo per ogni area strutturale identificata nel passaggio precedente. Per allineare le sequenze di residui delle due proteine, in primo luogo, ottenere le sequenze di amminoacidi complete delle proteine donatrici e recettori in APE.
Come in precedenza, aprite la sequenza di DNA del donatore, selezionatela e fate clic su Traduci ORF (ORFs translate). Quindi, accedere alla pagina web di Clustal Omega e quindi mettere le sequenze di amminoacidi delle due proteine. Ogni sequenza deve essere proceduto con una riga di testo con nome proteico da identificare correttamente.
Scorrere verso il basso e fare clic su Invia. Recuperare il file di allineamento facendo clic sulla scheda del file di allineamento del download e salvarlo. Questo file può essere aperto da qualsiasi programma di modifica del testo.
Usando il file di allineamento come riferimento, annotare le corrispondenti regioni strutturali della proteina donatrice nella loro sequenza di DNA. Creare una copia della sequenza di DNA annotata della proteina recettore e rinominarla come proteina kimerica. Aprire la sequenza di DNA rinominata in APE.
Selezionare la regione da scambiare nella proteina donatrice, quindi selezionare la regione corrispondente nella proteina del recettore rinominata. Incollare la sequenza di DNA della proteina donatrice, quindi salvare i cambiamenti. Progettare i primer terminali utilizzando un editor di DNA come APE.
Crea un nuovo file di DNA, avvia il primer terminale finale con una sequenza di leader. Seguito dal primo sito di restrizione selezionato nei vettori MCS e dal distanziale opzionale nelle coppie di basi iniziali da 18 a 27 del gene di interesse. Nel nuovo file del DNA, progettare la sequenza del primer terminale C per iniziare con le ultime 18-27 coppie di basi del gene di interesse seguite da un distanziale opzionale, il secondo sito di restrizione scelto e la sequenza di leader.
Evidenziare l'intera sequenza, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare il complimento inverso per ottenere il primer inverso. Ora, progetta primer per ciascuna delle regioni di confine nei costrutti kimerici. Nella sequenza di DNA della kimera, evidenziare una regione di coppia di 30 basi nella zona in cui le sequenze originali e inserite sono in contatto.
Questo è composto da 15 coppie di basi in ogni sequenza. Copiare la regione e incollarla in un nuovo file di DNA. Questa sequenza sarà il primer in avanti.
Creare una copia del primer in avanti generato nel passaggio precedente e rinominarla come primer inverso. Evidenziate la sequenza di primer, fate clic con il pulsante destro del mouse e selezionate il complimento inverso per generare la sequenza di primer inverso. Ripetere questi passaggi per ogni zona di contatto nella sequenza di DNA kimerico.
Generalmente, due serie di primer inversi in avanti sono necessari per generare una kimera, a meno che la sostituzione non avvenga nelle regioni terminali N o C. Preparare una singola miscela di reazione PCR per ciascuno dei frammenti che compongono la proteina kimerica. Impostare innanzitutto un tubo di microfuso di un punto cinque mililiter su ghiaccio e pipettare i diversi reagenti delle miscele PCR nell'ordine indicato nel protocollo di testo.
Assicurarsi che per ogni reazione PCR vengano utilizzati primer e modelli corretti. Etichettare due tubi PCR a zero punti con pareti sottili per ogni reazione e trasferire 20 microlitri della corrispondente miscela PCR in ogni tubo. Trasferire i tubi PCR in un termociclometro PCR e avviare il protocollo come descritto nel protocollo di testo.
Al termine della reazione PCR, aggiungere quattro microlitri di sei x buffer di carico del DNA in ogni tubo. Inserire il gel di agaross dell'uno per cento in un'unità di elettroforesi e coprire con tampone TAE. Caricare con cura i campioni nel gel insieme a un secondo peso molecolare.
Dopo aver espulso il gel a 80-120 volt per 20-45 minuti, spegnere l'unità di elettroforesi e rimuovere il gel agoross. Visualizza le bande di DNA amplificate sotto la luce UV. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare i singoli frammenti di DNA dal gel e trasferirli in due tubi di microfusore mililiter etichettati.
Dopo aver utilizzato un kit di pulizia PCR per purificare i frammenti di DNA, quantificare la quantità di DNA recuperato misurando l'assorbanza dei campioni a 260 nanometri e 340 nanometri in uno spettrofetometro. Ora, esegui l'amplificazione PCR per generare la sequenza di DNA kimerico. In primo luogo, impostare 50 microlitri di una reazione PCR per fondere i costituenti separati della kimera come prima.
Impiega i primer terminali N e C insieme a 10 nanogrammi di ciascuno dei frammenti di DNA amplificati. Recuperare e quantificare il frammento di DNA purificato come prima, in 30 microlitri di acqua priva di nucleo. Questo frammento contiene la sequenza di DNA kimerico affiancata dai siti di restrizione inclusi nei primer terminali.
La generazione di una proteina kimerica è esemplificata con due membri della famiglia degli inter luca e sei sitochine. Oncostatale M nel fattore inibitorio della leucemia. Il kimera di sollevamento OSM deriva dallo scambio della regione del ciclo BC di OSM con una corrispondente sequenza di sollevamento.
La prima fase di amplificazione pcr consisteva in tre reazioni separate. Il frammento OSM N-terminale, che richiedeva n-terminale OSM forward e BC start reverse primer usava OSM come modello. Il ciclo LIF BC è stato ottenuto attraverso i primer inversi BC start forward e BC N usando LIF come modello.
Il frammento OSM del terminale C utilizzava i primer inversi BC end forward e C terminal OSM, nonché L'OSM come modello. Questi frammenti purificati sono stati quindi usati come modello nella seconda reazione PCR insieme ai primer inversi OSM forward e C-terminal OSM per amplificare la corrispondente sequenza genica del ciclo OSM LIF BC. In seguito alla purificazione e alla trasformazione in e-coli, i singoli plasmidi sono stati isolati e schermati dalla digestione enzimatica di restrizione per un corretto inserimento del frammento di DNA.
L'elettroforesi del gel ha rivelato colpi positivi che sono stati poi inviati per la verifica della sequenza. Le proteine kimeriche devono essere prodotte e l'attività misurata in un perfetto sistema di fazione. Al fine di determinare l'importanza delle regioni sostituite per quella particolare fazione.
Questa tecnica è stata molto utile e frequentemente applicata, interferito con recettori segnalanti al fine di identificare i domini delle funzioni chiave e i siti di riconoscimento dei recettori. Il numero che uso per l'elettroforesi del DNA deve essere maneggiato usando guanti monouso, un cappotto da laboratorio e occhiali protettivi.
