Utilizando los ensayos presentados aquí, se puede evaluar la diferencia en el fenotipo entre las cepas de rotavirus, donde se aíslan las cepas únicas. Específicamente, se investiga el cambio fenotípico de cepas de rotavirus resistentes al desinfectante. Para lograr salidas cuantitativas claras utilizando el ensayo de placa, es fundamental seleccionar una combinación adecuada de cepa de rotavirus y suero, en la que el rotavirus esté bien adaptado al suero.
Demostrar el procedimiento será Syun-suke Kadoya, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Retire un CryoTube que contenga líneas celulares MA104 del recipiente de nitrógeno líquido. Coloque el CryoTube en un baño de agua a 37 grados centígrados para descongelar las células.
Añadir un mililitro de la suspensión celular a 20 mililitros del medio que contiene suero en un matraz T75. Incubar el matraz en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante dos o tres días. Una vez que la monocapa celular alcance el 80% de confluencia, retire el sobrenadante y lave las células dos veces con cinco mililitros de PBS de 1X Dulbecco.
Añadir cuatro mililitros de 0.05%trypsin-EDTA al matraz, e incubar a 37 grados Celsius durante cinco minutos para separar las células del matraz. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros y centrifugar a 190 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend las células peletadas en un mililitro de medio que contiene suero.
Luego diluir las células resuspendidas 100 veces con el medio. Agregue tres mililitros de la suspensión celular diluida a cada pozo de una placa de seis pozos para el ensayo de placa. Agregue un mililitro de la suspensión celular diluida a cada pozo de una placa de 24 pozos para el ensayo de unión celular.
Incubar las placas en una incubadora a 37 grados centígrados y vapor subsaturado de 5%CO2 durante dos o tres días. Transfiera un tubo que contenga un mililitro de suspensión del virus en medio libre de suero de almacenamiento a menos 80 grados centígrados a un baño de agua de 37 grados centígrados para descongelar. Añadir un microgramo por microlitro de tripsina del páncreas porcino a un mililitro de la suspensión del virus y luego vórtice.
Incubar la suspensión del virus a 37 grados centígrados y al 5%de CO2 de vapor subsaturado durante 30 minutos. Diluir la suspensión del virus activado con un medio libre de suero para ajustar la multiplicidad de infección, o MOI, a 0,1 pfu por célula. Añadir un mililitro de la suspensión del virus diluido a las células MA104 en un matraz T75 tres días después del enchapado celular.
Incubar las células con virus a 37 grados centígrados durante una hora, agitando suavemente el matraz cada 15 minutos. A continuación, añada 30 mililitros de un medio libre de suero que contenga cuatro microgramos por mililitro de tripsina desde el páncreas porcino al matraz. Incubar el matraz a 37 grados centígrados y 5%co2 de vapor insaturado.
Recoger un mililitro del sobrenadante en el matraz en cero, seis, 12, 18, 24 y 36 horas después de la infección, y reemplazar el sobrenadante en los tipos de 1,5 mililitros utilizando una pipeta. Llevar a cabo un ciclo de congelación y descongelación en 15 minutos a menos 80 grados Centígrados seguido de un derretimiento de 15 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados. Luego centrifugar los tubos a 12, 600 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Recoge el sobrenadante. Filtrar el sobrenadante con un filtro destilado de 0,2 micras para eliminar la fracción celular. Almacene el sobrenadante a menos 80 grados Centígrados hasta que lo aplique al ensayo de placa para medir el título del virus.
Cuando esté listo para realizar el ensayo de placa, coloque los tubos que contienen el sobrenadante recogido en un baño de agua a 37 grados centígrados. Añadir la trippsina a un mililitro de muestra diluida de 10 veces, e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Durante esta incubación de 30 minutos, lave cuidadosamente las células MA104 en una placa de seis pocillos con dos mililitros de 1X PBS después de retirar el medio que contiene suero.
Diluir en serie las muestras incubadas con medio libre de suero e inocular un mililitro de la muestra diluida en cada pozo. Incubar la placa durante 90 minutos a 37 grados Celsius y 5%CO2 de vapor subsaturado, agitando suavemente la placa cada 15 minutos. Después de la incubación, retire el inóculo de la placa de seis pocillos.
Añadir cuatro microgramos por mililitro de trippsina al medio preparado. Añadir suavemente pero inmediatamente tres mililitros del medio mezclado con gel de agarosa a cada pozo. Deje que el gel de agarosa se solidifique a temperatura ambiente durante más de 10 minutos.
Luego incubar la placa durante dos días a 37 grados Celsius y 5%CO2 vapor subsaturado. A continuación, añadir un mililitro de 0.015%Neutral Red solución diluida con 1X PBS a cada pozo, e incubar con las mismas condiciones. Retire el tinte después de tres horas y continúe incubando durante un día.
Al día siguiente, cuente el número de placas en cada pozo y calcule el pfu por mililitro. Revise cuidadosamente la confluencia celular antes del ensayo de placa para asegurar los números de placa. Para el ensayo de unión celular, agregue un microgramo por microlitro de tripsina de un páncreas porcino a un mililitro de la suspensión del virus, y luego vórtice.
Diluir la suspensión del virus con un medio libre de suero para ajustar el MOI a un pfu por célula. Lave las células MA104 dos veces en una placa de 24 pozos con un mililitro de solución salina tris-buffered. Ahora inocular las células con 100 microlitros de suspensión de virus diluido en cada pozo de la placa de 24 pozos.
Incubar la placa a cuatro grados centígrados durante 90 minutos con un suave temblor cada 15 minutos. Retire el inóculo del virus y lave las células dos veces con un mililitro de solución salina con tris-buffered. Para extraer el ARN de doble cadena del rotavirus, agregue 140 microlitros de 1X PBS y 560 microlitros del tampón de extracción de ARN a cada pozo.
Mezclar adecuadamente con una pipeta hasta que no se vea la neblina de las células en el búfer. Después de recuperar el ARN de doble cadena, de acuerdo con el protocolo del fabricante, coloque los tubos de 1,5 mililitros, que contienen el extracto de ARN de doble cadena, en un bloque de calor a 95 grados centígrados durante cinco minutos para desnaturalizar el ARN. A continuación, coloque inmediatamente los tubos sobre hielo e incubar durante más de dos minutos.
Sintetice el ADNc utilizando un kit de transcripción inversa. Añadir cuatro microlitros de solución de ARN viral desnaturalado a un tubo de PCR que contenga 16 microlitros de mezcla de reacción, y mezclarlos cuidadosamente con una pipeta para no generar burbujas. Después de girar por los tubos, realice la transcripción inversa con un termociclador.
Para la PCR cuantitativa, utilice una sonda quencher-inserting dirigida a la región 963 a 1, 049 del segmento del genoma NSP3 del rotavirus. Diluir en serie el plásmido estándar con agua de grado PCR, y proceder a hacer la mezcla maestra para PCR cuantitativo. Agregue 20 microlitros de la mezcla maestra a los pozos de una placa PCR de 96 pozos.
A continuación, mezcle cinco microlitros de muestras de ADNn a o cinco microlitros del plásmido estándar pipeteando 10 veces. Realice pcR cuantitativo de acuerdo con las condiciones del protocolo de texto. Por último, calcule el genoma del rotavirus enlazado a la superficie celular MA104 como se describe en el protocolo de texto.
Aquí se muestra una curva de crecimiento del rotavirus. Al aplicar el método mínimo cuadrado a un modelo Gompertz modificado, se estima que la tasa de crecimiento específica es de 0,197, y el período de retraso se estima en 6,61 horas. El título de virus relativo en la fase estacionaria hasta el título inicial es 3.15.
De los seis clones de rotavirus analizados, los valores estimados de la tasa de crecimiento específica oscilaron entre 0,19 y 0,27. Estos valores estimados son fiables porque el coeficiente de valores de determinación en el empalme del modelo es superior a 0,98. El resultado del ensayo de unión celular se muestra como una eficiencia de unión, que es la relación entre las partículas virales unidas y las presentes en el inóculo.
Nuestros viriones RV que se une a superficies celulares son de aproximadamente 10.000 copias por mililitro con una eficiencia de unión de alrededor del 1% cuando se utiliza una placa de 24 pozos para el ensayo de unión de celdas. Dado que las células cultivadas son sensibles al estrés físico, tenga cuidado de verter el tampón y el agar suavemente pero rápidamente. Esencialmente, se ha introducido un nuevo sistema para los virus.
Usando este sistema, podemos evaluar la capacidad real de unión celular y la tasa de crecimiento específica con instrumentos. Nuestro protocolo es ventajoso en la medición del rasgo fenotípico. Al comprobar diferentes cepas recién surgientes, puede ayudar a evaluar sus nuevas vacunas para los virus.
Los virus se designan como patógenos BSL-2, por lo que tendrá que preparar salas experimentales BSL-2 para realizar este procedimiento.
