Este método es significativo porque se puede utilizar para obtener grandes cantidades de osteoclastos totalmente diferenciados in vitro. La principal ventaja de este método es que es más estable y seguro y aísla la médula ósea en menos tiempo y con menos esfuerzos en comparación con el procedimiento tradicional. Esta técnica puede proporcionar una fuente estable de osteoclastos, que son el objeto importante de la enfermedad metabólica ósea, incluyendo osteoporosis, parodontitis, y osteolisis periprotésica.
Con modificaciones menores, este protocolo también puede ser apropiado para obtener varios tipos de médula ósea derivadas de las células en ratas u otros animales. Para empezar, coloque animales eutanizados en una tabla desinfectada en una posición supina. Usando tijeras estériles, haga una incisión de aproximadamente un centímetro de longitud en el fémur proximal para pelar la piel.
A continuación, disecciona los fémures y tibias. Con cuidado y suavemente, corte las partes de conexión bilaterales alrededor de las articulaciones de la cadera, la rodilla y el tobillo para aislar las tibias y los fémures. Corta parte de los tejidos alrededor del hueso, asegurándote de ser minucioso.
A continuación, coloque los huesos limpios en un plato con cinco mililitros de medio de cultivo completo. Use tijeras estériles para cortar el hueso largo. Utilice una aguja de jeringa de un mililitro para lavar cuidadosamente la cavidad de la médula con 10 mililitros de medios completos hasta que la cavidad de la médula se vuelva blanca.
Transfiera esta suspensión celular a un tubo de 50 mililitros y filtre con un colador de 70 micrómetros para eliminar el tejido restante. Agregue cinco mililitros de tampón de lelisis de sangre roja e incubar las células sobre hielo durante ocho minutos. Después de esto, centrifugar las células a 250 veces G durante cinco minutos para producir el pellet celular.
Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 10 mililitros de medios completos. Utilice un hemocitociómetro para contar las celdas y calcule el tiempo dedicado a las acciones realizadas para este método. En primer lugar, coloque a los animales eutanizados en una tabla desinfectada en una posición supina.
Usando tijeras estériles, haga una incisión de aproximadamente un centímetro de longitud en el fémur proximal para pelar la piel. A continuación, disecciona los fémures y tibias. Cortar las partes de los tejidos alrededor del hueso, aunque no hay necesidad de extraer el tejido por completo.
Enjuague las tibias y los fémures con 12 mililitros de PBS, y luego córtelos por la mitad. Coloque las tibias y fémures cortados en una punta de pipeta preparada de un mililitro, y colóquela en un tubo de micro centrífuga preparado. Centrifugar el tubo tres veces a 1.000 veces G y a cuatro grados centígrados durante 45 segundos.
Después de esto, retire la punta de la pipeta que contiene el hueso del tubo, dejando la médula ósea en el tubo. Añadir 200 microlitros de PBS al tubo, y pipetear hacia arriba y hacia abajo repetidamente para desintegrar la médula a fondo. Transfiera esta suspensión celular a un tubo de 50 mililitros y filtre con un colador de 70 micrómetros para eliminar los tejidos restantes.
A continuación, utilice un hemocitociómetro para contar las celdas y calcule el tiempo dedicado a los pasos dados en esta sección. Añadir seis mililitros de solución de separación celular a un tubo centrífugo silicificado estéril. Agregue la suspensión celular diluida al tubo.
Después de agregar la suspensión, aparecerá un límite claro entre la capa de celdas y la solución de separación. A continuación, adhera una punta de pipeta a la superficie interior del tubo en un ángulo de 45 grados. Centrifugar la solución en capas en una centrífuga horizontal a 500 veces G durante 30 minutos.
Después de esto, aspirar la segunda capa turbia que contiene las celdas de destino de arriba a abajo. Transfiera las células de destino a un tubo nuevo. Agregue cinco mililitros de PBS para lavar las células, y centrifugar a 250 veces G durante cinco minutos.
Repita este proceso de lavado añadiendo PBS y centrifugando para un total de tres lavados. Resuspender el gránulo celular con medio de inducción de médula ósea. Usa un hemocitoómetro para contar las células.
Luego, agregue de cinco a ocho mililitros de medio de inducción de médula ósea para obtener una solución final de células de 300.000 células por mililitro. Agregue un mililitro de esta solución celular a cada pozo de una placa de 24 pozos. Después de incubar las células a 37 grados celsius durante 24 horas, aspira suavemente el medio y añade un mililitro de medio de inducción osteoclasal a cada pozo.
Agitar suavemente la placa y devolverla a la incubadora. Cada 48 horas, retirar y reemplazar 0,8 mililitros de medio de inducción osteoclasto de cada pozo. Agitar suavemente la placa antes de devolverla a la incubadora.
Para comenzar a pretratar las rodajas óseas, utilice una sierra microeléctrica para cortar la corteza ósea femoral bovina fresca en rodajas de dos centímetros de espesor a lo largo del eje longitudinal. Después de cortar y moler las rodajas, lave las rodajas sumergiéndolas en un vaso de agua desionizada y sometiéndolas a ultrasonido a 100 hercios durante una hora. Repita este proceso de lavado tres veces.
Sumerja las rodajas lavadas en 75% de alcohol durante dos horas. Luego, aspirar el alcohol y exponer cada diapositiva de rodajas a la luz ultravioleta durante una hora en una plataforma limpia. Para comenzar la tinción azul de toluidina, coloque las rodajas óseas pretratados en los pozos de la placa de 24 pozos.
Después de esto, agregue el medio de cultivo en la placa de 24 pozos para sumergir las rodajas óseas durante dos horas. Plantar e inducir las células como se demostró anteriormente. Después de que los osteoclastos hayan aparecido a los cuatro a seis días, lave las rodajas con un mililitro de hidróxido de amonio molar.
Sonicar las rodajas tres veces durante cinco minutos cada una para eliminar las células vivas y para permitir el análisis de los pozos de resorción en las rodajas óseas. A continuación, retire el hidróxido de amonio y manche las rodajas con un mililitro de 1% de solución azul de toluidina por rodaja durante dos minutos. Lave las rodajas de manchas con PBS.
Seleccione aleatoriamente cinco vistas y utilice un software de análisis de imágenes para realizar un análisis semicuantitativo del área de resorción. En primer lugar, prefije las rodajas óseas con un mililitro de 2,5% de glutaraldehído por rebanada durante dos horas a temperatura ambiente. Sonicar las rodajas prefijadas tres veces durante tres minutos cada una con un hidróxido de amonio molar para eliminar las células.
A continuación, retire el hidróxido de amonio y lave las rodajas óseas tres veces con PBS, con cada lavado que dure 12 minutos. Fije las rodajas óseas lavadas con 1%ácido osmico durante dos horas a temperatura ambiente. Realice la deshidratación de degradado de etanol como se describe en el protocolo de texto.
Después de esto, reemplace el etanol con acetato de isoamilo durante 15 minutos. Recubrir las rodajas con paladio dorado y analizarlas mediante microscopía electrónica de barrido. En este estudio, un gran número de precursores osteoclastos fueron aislados, purificados y con éxito inducidos a convertirse en osteoclastos.
Al complementar con M-CSF y RANKL, los osteoclastos gigantes se ven en los días cinco a seis. La formación de estos osteoclastos se identifica con éxito mediante la tinción de trampas. Las células grandes y púrpuras se consideran células positivas TRAP con múltiples núcleos.
A través de este método, es típico obtener 800 osteoclastos que contienen hasta 30 núcleos por osteoclasto en un plato de 24 pozos. En comparación con el método tradicional, este método mejorado ahorra aproximadamente 20 minutos durante todo el proceso de aislamiento. El uso de rodajas óseas para evaluar la actividad de la resorción ósea es un método in vitro típico.
A través de la tinción azul toluidina, el área de resorción se visualiza como verde claro. La estructura y las características de los pozos óseos se pueden observar claramente mediante microscopía electrónica de barrido. CTR, uno de los marcadores celulares específicos de osteoclastos, es fundamental para identificar osteoclastos y estudiar la formación de osteoclastos en el hueso.
La expresión positiva de CTR identifica claramente los osteoclastos y los distingue de los poliárarios macrófagos. El CTR está claramente indicado en los ensayos de inmunofluorescencia por un color verde, mientras que el azul indica los núcleos celulares. Asegúrese de no fracturar los fémures y las tibias para evitar la pérdida de médula ósea.
Un individuo que nunca ha realizado esta técnica antes puede tener problemas al ayudar a la solución de operación de las células. La punta de la pipeta debe adherirse a la superficie interior del tubo y mantenerse en un ángulo de 45 grados con respecto a la superficie interior.
