この方法は、インビトロで大量の完全に分化された破骨細胞を得るために使用することができるので重要である。この方法の主な利点は、それがより安定して安全であり、従来の進行に比べて少ない時間で、より少ない努力で骨髄を分離することです。この技術は、骨粗鬆症、パロドンティス、骨形成炎を含む骨代謝疾患の重要な目的である破骨細胞の安定した供給源を提供することができる。
軽微な改変により、このプロトコルはまた、ラットまたは他の動物の細胞に由来する様々な種類の骨髄を得るために適切であり得る。まず、安楽死させた動物を、麻酔付きのボード上の、サピインの位置に置きます。滅菌はさみを使用して、皮膚を剥がすために近位大腿骨で約1センチメートルの長さの切開を行います。
次に、大腿骨と脛骨を解剖する。慎重かつ穏やかに、脛骨と大腿骨を分離するために、股関節、膝関節、足首関節の周りの両側接続部分を切断します。骨の周りの組織の一部を切断し、徹底的であることを確認します。
その後、洗浄した骨を5ミリリットルの完全な培養培地で皿に入れます。長い骨を切り落とすために無菌はさみを使用してください。1ミリリットルの注射針を使用して、骨髄腔が白くなるまで10ミリリットルの完全な媒体で慎重に骨髄腔を洗い流します。
この細胞懸濁液を50ミリリットルチューブに移し、70マイクロメートルのストレーナーで濾過して残りの組織を取り除きます。5ミリリットルの赤血球のリシスバッファーを加え、氷上の細胞を8分間インキュベートします。この後、細胞ペレットを得るために5分間Gの250倍のGで細胞を遠心分離する。
上清を吸引し、完全な培地の10ミリリットルで細胞を再懸濁します。ヘモサイトメーターを使用してセルをカウントし、このメソッドに対して実行されたアクションに費やした時間を計算します。まず、安楽死させた動物を、麻酔付きの位置に除菌したボードの上に置きます。
滅菌はさみを使用して、皮膚を剥がすために近位大腿骨で約1センチメートルの長さの切開を行います。次に、大腿骨と脛骨を解剖する。骨の周りの組織の部分を切断します, 完全に組織を除去する必要はありませんが、.
12ミリリットルのPBSでティビアスと大腿骨をすすいでから半分に切ります。切り取ったティビアスと大腿骨を準備した1ミリリットルのピペットチップに入れ、これを準備したマイクロ遠心管に入れる。チューブを1,000倍Gで3回、摂氏4度で45秒間遠心分離します。
この後、骨を含むピペットチップをチューブから取り出し、骨髄をチューブに残します。チューブにPBSの200マイクロリットルを追加し、ピペットを繰り返し上下にして骨髄を完全に崩壊します。この細胞懸濁液を50ミリリットルチューブに移し、70マイクロメートルのストレーナーで濾過して残りの組織を取り除きます。
次に、ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、このセクションで取ったステップに費やした時間を計算します。滅菌された分離チューブに6ミリリットルの細胞分離溶液を加えます。希釈した細胞懸濁液をチューブに加えます。
懸濁液を添加すると、細胞の層と分離溶液の間に明確な制限が現れます。次に、ピペット先端をチューブの内面に45度の角度で付着させる。重層溶液をG500倍で水平遠心分離機で30分間遠心する。
この後、ターゲット細胞を含む曇りの第2層を上から下に吸引する。ターゲットセルを新しいチューブに移します。5ミリリットルのPBSを加え、細胞を洗浄し、遠心分離機をGの250倍で5分間加える。
PBSと遠心分離機を加えて、この洗浄工程を合計3回洗浄します。骨髄誘導培地で細胞ペレットを再懸濁する。細胞を数えるために、ヘモサイトメーターを使用してください。
次いで、骨髄誘導培地を5~8ミリリットル加え、1ミリリットル当たり300,000個の細胞の最終的な細胞溶液を得る。24ウェルプレートの各ウェルにこのセル溶液の1ミリリットルを追加します。24時間摂氏37度で細胞をインキュベートした後、培地を軽く吸引し、各ウェルに1ミリリットルの破骨細胞誘導培地を加える。
プレートを軽く攪拌し、インキュベーターに戻します。48時間ごとに、各井戸から0.8ミリリットルの破骨細胞誘導培地を取り除き、交換します。プレートを静かに攪拌してから、インキュベーターに戻します。
骨のスライスの前処理を開始するには、マイクロ電気ソーを使用して、新鮮な牛の大腿骨骨皮質を縦軸に沿って2センチメートルの厚さのスライスにカットします。スライスを切断して粉砕した後、スライスを脱イオン水のビーカーに浸して洗浄し、100ヘルツで1時間超音波にします。この洗浄工程を3回繰り返します。
洗浄したスライスを75%アルコールに2時間浸します。その後、アルコールを吸引し、きれいなプラットフォーム上で1時間紫外線にスライスの各スライドを公開します。トルイジンブルー染色を開始するには、前処理された骨スライスを24ウェルプレートのウェルに入れる。
この後、培養液を24ウェルプレートに加え、骨スライスを2時間浸漬する。前に示したように細胞を植え、誘導する。破骨細胞が4〜6日に出現した後、0.25モル水酸化アンモニウムの1ミリリットルでスライスを洗います。
スライスを3回5分間超音波処理して、生きている細胞を取り除き、骨スライスの吸収ピットの分析を可能にします。次に、水酸化アンモニウムを取り除き、スライスあたり1%トルイジンブルー溶液1ミリリットルでスライスを2分間染色します。PBSで汚れスライスを洗います。
ランダムに5つのビューを選択し、画像解析ソフトウェアを使用して、再吸収領域の半定量的な分析を実行します。まず、骨スライスに1ミリリットルの2.5%グルタルアルデヒドを室温で2時間付けます。接頭辞を付けたスライスを3回3分間、それぞれ1つの水酸化アンモニウム大臼歯で超音波処理し、細胞を除去する。
その後、水酸化アンモニウムを取り出し、PBSで骨スライスを3回洗浄し、各洗浄を12分間持続させます。洗浄した骨スライスを1%オズミック酸で室温で2時間固定します。テキストプロトコルで概説されているように、エタノール勾配脱水を行います。
この後、エタノールを酢酸イソアミルに15分間交換します。スライスに金のパラジウムをコーティングし、走査型電子顕微鏡で分析します。本研究では、多数の破骨細胞前駆体が単離され、精製され、破骨細胞になることに成功した。
M-CSFとRANKLを補うことによって, 巨大な破骨細胞は、日に見られます 5 から 6.これらの破骨細胞の形成は、トラップ染色によって正常に同定される。大きい紫の細胞は、複数の核を持つTRAP陽性細胞とみなされます。
この方法を通して、24ウェルプレートで破骨細胞当たり30個もの核を含む800個の破骨細胞を得ることが典型的である。従来の方法と比較して、この改良された方法は、全体の分離プロセス中に約20分を節約します。骨の吸収の活性を評価するために骨スライスを使用することは、典型的なin vitro方法です。
トルイジンブルー染色を通して、再吸収領域はライトグリーンとして視覚化される。骨盤の構造や特性は、走査型電子顕微鏡で明らかに観察することができる。CTRは、破骨細胞の特定の細胞マーカーの1つであり、破骨細胞を同定し、骨の破骨細胞の形成を研究するために重要である。
CTRの陽性の発現は、明確に破骨細胞を識別し、マクロファージポリカルリオンとそれらを区別します。CTRは、蛍光免疫アッセイでは緑色で明確に示され、青色は細胞の核を示す。骨髄を失わないように大腿骨と脛骨を骨折しないようにしてください。
これまでこの技術を行ったことがない人は、細胞操作溶液を助けるときに苦労する可能性があります。ピペット先端は管の内面に付着し、内面に45度の角度で保たれなければならない。
