Este método é significativo porque pode ser usado para obter grandes quantidades de osteoclastas totalmente diferenciadas in vitro. A principal vantagem deste método é que ele é mais estável e seguro e isola a medula óssea em menos tempo e com menos esforços em comparação com o processo tradicional. Esta técnica pode fornecer uma fonte estável de osteoclatos, que são o objeto importante da doença metabólica óssea, incluindo osteoporose, parodonte e osteolise periprotética.
Com pequenas modificações, este protocolo também pode ser apropriado para a obtenção de vários tipos de medula óssea derivadas das células em ratos ou outros animais. Para começar, coloque animais eutanizados em uma tábua desinfetada em uma posição supina. Usando uma tesoura estéril, faça uma incisão de aproximadamente um centímetro de comprimento no fêmur proximal para descascar a pele.
Em seguida, disseque os fêmures e tíbias. Com cuidado e cuidado, corte as partes de conexão bilaterais ao redor das articulações do quadril, joelho e tornozelo para isolar as tíbias e os fêmures. Corte parte dos tecidos ao redor do osso, certificando-se de ser minucioso.
Em seguida, coloque os ossos limpos em um prato com cinco mililitros de meio de cultura completa. Use uma tesoura estéril para cortar o osso longo. Use uma agulha de seringa de um mililitro para lavar cuidadosamente a cavidade da medula com 10 mililitros de mídia completa até que a cavidade da medula fique branca.
Transfira esta suspensão celular para um tubo de 50 mililitros e filtre-a com um coador de 70 micrômetros para remover o tecido restante. Adicione cinco mililitros de tampão de sangue vermelho e incuba as células no gelo por oito minutos. Depois disso, centrifugar as células a 250 vezes G por cinco minutos para produzir a pelota celular.
Aspire o supernasce e resuspenda as células em 10 mililitros de mídia completa. Use um hemótmetro para contar as células e calcular o tempo gasto nas ações tomadas para este método. Primeiro, coloque animais eutanizados em uma tábua desinfetada em uma posição supina.
Usando uma tesoura estéril, faça uma incisão de aproximadamente um centímetro de comprimento no fêmur proximal para descascar a pele. Em seguida, disseque os fêmures e tíbias. Corte as partes dos tecidos ao redor do osso, embora não haja necessidade de remover o tecido completamente.
Enxágüe as tíbias e os fêmures com 12 mililitros de PBS, e depois corte-os ao meio. Coloque as tíbias e os fêmures cortados em uma ponta de pipeta de um mililitro preparado, e coloque-a em um tubo de micro centrífuga preparado. Centrifugar o tubo três vezes a 1.000 vezes G e a 4 graus Celsius por 45 segundos.
Depois disso, remova a ponta da pipeta contendo o osso do tubo, deixando a medula óssea no tubo. Adicione 200 microliters de PBS ao tubo, e pipeta para cima e para baixo repetidamente para desintegrar a medula completamente. Transfira esta suspensão celular para um tubo de 50 mililitros e filtre-a com um coador de 70 micrômetros para remover os tecidos restantes.
Em seguida, use um hemócito para contar as células e calcular o tempo gasto nas etapas tomadas nesta seção. Adicione seis mililitros de solução de separação celular a um tubo centrífugo silicificado estéril. Adicione a suspensão da célula diluída ao tubo.
Após a adição da suspensão, aparecerá um limite claro entre a camada das células e a solução de separação. Em seguida, adere uma ponta de pipeta à superfície interna do tubo em um ângulo de 45 graus. Centrifugar a solução em camadas em uma centrífuga horizontal a 500 vezes G por 30 minutos.
Depois disso, aspire a segunda camada nublada que contém as células-alvo de cima para baixo. Transfira as células-alvo para um novo tubo. Adicione cinco mililitros de PBS para lavar as células, e centrífuga a 250 vezes G por cinco minutos.
Repita este processo de lavagem adicionando PBS e centrifugando para um total de três lavagens. Resuspenque a pelota celular com meio de indução de medula óssea. Use um hemótmetro para contar as células.
Em seguida, adicione cinco a oito mililitros de meio de indução de medula óssea para obter uma solução de células finais de 300.000 células por mililitro. Adicione um mililitro desta solução celular a cada poço de uma placa de 24 poços. Depois de incubar as células a 37 graus Celsius por 24 horas, aspire suavemente o meio e adicione um mililitro de meio de indução de osteoclato para cada poço.
Agitar suavemente a placa e devolvê-la à incubadora. A cada 48 horas, remova e substitua 0,8 mililitros de meio de indução osteoclasta de cada poço. Agitar a placa suavemente antes de devolvê-la à incubadora.
Para começar a pré-tratar as fatias ósseas, use uma micro serra elétrica para cortar o córtex ósseo femoral bovino fresco em fatias de dois centímetros de espessura ao longo do eixo longitudinal. Depois de cortar e moer as fatias, lave as fatias imergindo-as em um béquer de água desionizada e submetendo-as ao ultrassom a 100 hertz por uma hora. Repita este processo de lavagem três vezes.
Mergulhe as fatias lavadas em 75% de álcool por duas horas. Em seguida, aspire o álcool e exponha cada slide de fatias à luz ultravioleta por uma hora em uma plataforma limpa. Para começar a coloração azul de toluidina, coloque as fatias ósseas pré-tratadas nos poços da placa de 24 poços.
Depois disso, adicione o meio cultura na placa de 24 poços para imergir as fatias ósseas por duas horas. Plante e induza as células como demonstrado anteriormente. Depois que os osteoclatos aparecerem em quatro a seis dias, lave as fatias com um mililitro de 0,25 hidróxido de amônio molar.
Sonicar as fatias três vezes por cinco minutos cada para remover as células vivas e permitir a análise das fossas de resorção nas fatias ósseas. Em seguida, remova o hidróxido de amônio e manche as fatias com um mililitro de solução azul toluidina de 1%toluidina por fatia por dois minutos. Lave as fatias de manchas com PBS.
Selecione aleatoriamente cinco visualizações e use um software de análise de imagem para realizar uma análise semi-quantitativa da área de reabsorção. Primeiro, prefixe as fatias ósseas com um mililitro de 2,5% glutaraldeído por fatia por duas horas em temperatura ambiente. Sonicar as fatias prefixadas três vezes por três minutos cada com um hidróxido de amônio molar para remover as células.
Em seguida, retire o hidróxido de amônio e lave as fatias ósseas três vezes com PBS, com cada lavagem com duração de 12 minutos. Fixar as fatias ósseas lavadas com ácido 1%osmímico por duas horas em temperatura ambiente. Realize a desidratação do gradiente de etanol conforme descrito no protocolo de texto.
Depois disso, substitua o etanol por acetato isoamyl por 15 minutos. Cubra as fatias com paládio de ouro e analise-as escaneando microscopia eletrônica. Neste estudo, um grande número de precursores osteoclatos foram isolados, purificados e induzidos com sucesso para se tornarem osteoclartos.
Ao suplementar com M-CSF e RANKL, os osteoclartos gigantes são vistos nos dias cinco a seis. A formação desses osteoclastos é identificada com sucesso pela coloração da armadilha. Células grandes e roxas são consideradas células trap positivas com múltiplos núcleos.
Através deste método, é típico obter 800 osteoclartos contendo até 30 núcleos por osteoclato em uma placa de 24 poços. Em comparação com o método tradicional, este método aprimorado economiza aproximadamente 20 minutos durante todo o processo de isolamento. O uso de fatias ósseas para avaliar a atividade da resorção óssea é um método in vitro típico.
Através da coloração azul toluidina, a área de resorção é visualizada como verde claro. A estrutura e características dos poços ósseos podem ser claramente observadas pela microscopia eletrônica de varredura. A CTR, um dos marcadores celulares específicos dos osteoclatos, é fundamental para identificar os osteoclatos e estudar a formação de osteoclatos no osso.
A expressão positiva da CTR identifica claramente os osteoclatos e os distingue dos policaons macrófagos. A CTR é claramente indicada nos ensaios de imunofluorescência por uma cor verde, enquanto o azul indica os núcleos celulares. Certifique-se de não fraturar os fêmures e as tíbias para evitar perder medula óssea.
Um indivíduo que nunca realizou essa técnica antes pode ter dificuldades ao auxiliar na solução de operação das células. A ponta da pipeta deve ser aderida à superfície interna do tubo e mantida em um ângulo de 45 graus à superfície interna.
