Diese Methode ist wichtig, weil sie verwendet werden kann, um große Mengen vollständig differenzierter Osteoklasten in vitro zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass sie stabiler und sicherer ist und das Knochenmark in weniger Zeit und mit weniger Aufwand im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren isoliert. Diese Technik kann eine stabile Quelle von Osteoklasten bieten, die das wichtige Objekt der Knochenstoffwechselerkrankungen sind, einschließlich Osteoporose, Parodontitis und periprosthetische Osteolyse.
Bei geringfügigen Modifikationen kann dieses Protokoll auch geeignet sein, um verschiedene Arten von Knochenmark zu erhalten, die von den Zellen bei Ratten oder anderen Tieren abgeleitet wurden. Zunächst sollten eingeschläferte Tiere auf ein desinfiziertes Brett in eine Supine-Position gebracht werden. Mit steriler Schere, machen Sie einen Schnitt etwa einen Zentimeter lang am proximalen Oberschenkelknochen, um die Haut zu schälen.
Als nächstes sezieren Sie die Oberschenkelknochen und Tibias. Sorgfältig und sanft, schneiden Sie die bilateralen Verbindungsteile um die Hüfte, Knie und Knöchelgelenke, um die Tibias und Oberschenkelknochen zu isolieren. Schneiden Sie einen Teil des Gewebes um den Knochen herum ab, um sicherzustellen, dass sie gründlich sind.
Dann legen Sie die gereinigten Knochen in ein Gericht mit fünf Milliliter neines kompletten Kulturmedium. Verwenden Sie eine sterile Schere, um den langen Knochen abzuschneiden. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritzennadel, um die Markhöhle vorsichtig mit 10 Millilitern kompletter Medien zu spülen, bis die Markhöhle weiß wird.
Übertragen Sie diese Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Rohr und filtern Sie sie mit einem 70-Mikrometer-Sieb, um das restliche Gewebe zu entfernen. Fügen Sie fünf Milliliter roter BlutlysePuffer, und inkubieren sie die Zellen auf Eis für acht Minuten. Danach zentrieren Sie die Zellen bei 250 mal G für fünf Minuten, um das Zellpellet zu erhalten.
Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 10 Millilitern vollständiger Medien wieder aus. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen, und berechnen Sie die Zeit, die für die für diese Methode ausgeführten Aktionen aufgewendet wurde. Erstens, legen Sie eingeschläferte Tiere auf ein desinfiziertes Brett in einer Supine-Position.
Mit steriler Schere, machen Sie einen Schnitt etwa einen Zentimeter lang am proximalen Oberschenkelknochen, um die Haut zu schälen. Als nächstes sezieren Sie die Oberschenkelknochen und Tibias. Schneiden Sie die Teile des Gewebes um den Knochen, obwohl es keine Notwendigkeit, das Gewebe vollständig zu entfernen.
Spülen Sie die Tibias und Oberschenkelknochen mit 12 Milliliter PBS, und schneiden Sie sie dann in die Hälfte. Die geschnipste Tibias und Oberschenkelknochen in eine vorbereitete Ein-Milliliter-Pipettenspitze geben und in ein vorbereitetes Mikrozentrifugenrohr geben. Zentrifugieren Sie das Rohr dreimal bei 1 000 mal G und bei vier Grad Celsius für 45 Sekunden.
Entfernen Sie danach die Pipettenspitze, die den Knochen enthält, aus dem Rohr und lassen Sie das Knochenmark im Rohr zurück. Fügen Sie 200 Mikroliter PBS in das Rohr und Pipette immer wieder nach oben und unten, um das Mark gründlich zu zerlegen. Übertragen Sie diese Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Rohr und filtern Sie sie mit einem 70-Mikrometer-Sieb, um alle verbleibenden Gewebe zu entfernen.
Verwenden Sie dann ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen, und berechnen Sie die Zeit, die für die schritteinin in diesem Abschnitt aufgewendet wurde. Fügen Sie sechs Milliliter Zelltrennlösung in ein steriles silifiziertes Zentrifugalrohr. Fügen Sie die verdünnte Zellsuspension in das Rohr.
Nach dem Hinzufügen der Suspension wird eine klare Grenze zwischen der Zellschicht und der Trennlösung angezeigt. Als nächstes halten Sie eine Pipettenspitze in einem 45-Grad-Winkel an der Innenfläche des Rohres fest. Zentrifugieren Sie die geschichtete Lösung in einer horizontalen Zentrifuge bei 500 mal G für 30 Minuten.
Danach können Sie die trübe zweite Ebene ansaugen, die die Zielzellen von oben nach unten enthält. Übertragen Sie die Zielzellen in eine neue Röhre. Fügen Sie fünf Milliliter PBS hinzu, um die Zellen zu waschen, und Zentrifuge bei 250 mal G für fünf Minuten.
Wiederholen Sie diesen Waschvorgang, indem Sie PBS und Zentrifugieren für insgesamt drei Waschungen hinzufügen. Setzen Sie das Zellpellet mit Knochenmarkinduktionsmedium wieder auf. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen.
Fügen Sie dann fünf bis acht Milliliter Knochenmark-Induktionsmedium hinzu, um eine endgültige Zellenlösung von 300.000 Zellen pro Milliliter zu erhalten. Fügen Sie einen Milliliter dieser Zelllösung zu jedem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzu. Nach der Inkubation der Zellen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden, vorsichtig absaugen sie das Medium und fügen Sie jeweils einen Milliliter Osteoklast-Induktionsmedium zu jedem Brunnen hinzu.
Rühren Sie die Platte vorsichtig auf und bringen Sie sie zum Inkubator zurück. Entfernen und ersetzen Sie alle 48 Stunden 0,8 Milliliter Osteoklast-Induktionsmedium aus jedem Brunnen. Rühren Sie die Platte sanft, bevor Sie sie zum Inkubator zurückbringen.
Um mit der Vorbehandlung der Knochenscheiben zu beginnen, verwenden Sie eine mikroelektrische Säge, um den frischen Rinderfemoralknochenkortex in zwei Zentimeter dicke Scheiben entlang der Längsachse zu schneiden. Nach dem Schneiden und Schleifen der Scheiben, waschen Sie die Scheiben, indem Sie sie in einen Becher mit entionisiertem Wasser eintauchen und sie mit 100 Hertz für eine Stunde Ultraschall machen. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang dreimal.
Die gewaschenen Scheiben zwei Stunden lang in 75% Alkohol eintauchen. Dann, aspirieren Sie den Alkohol und setzen Sie jede Folie von Scheiben ultraviolettem Licht für eine Stunde auf einer sauberen Plattform. Um mit der blauen Färbung zu beginnen, legen Sie die vorbehandelten Knochenscheiben in die Brunnen der 24 Brunnenplatte.
Danach fügen Sie Kulturmedium in die 24 Brunnenplatte ein, um die Knochenscheiben für zwei Stunden einzutauchen. Pflanzen und induzieren Sie die Zellen, wie zuvor gezeigt. Nachdem Osteoklasten an vier bis sechs Tagen aufgetreten sind, waschen Sie die Scheiben mit einem Milliliter 0,25 Molar Ammoniumhydroxid.
Beschallen Sie die Scheiben dreimal für jeweils fünf Minuten, um die lebenden Zellen zu entfernen und die Analyse der Resorptionsgruben auf den Knochenscheiben zu ermöglichen. Dann entfernen Sie das Ammoniumhydroxid und färben Sie die Scheiben mit einem Milliliter 1%toluidinblauer Lösung pro Scheibe für zwei Minuten. Waschen Sie die Fleckenscheiben mit PBS.
Wählen Sie zufällig fünf Ansichten aus, und verwenden Sie eine Bildanalysesoftware, um eine semiquantitative Analyse des Resorptionsbereichs durchzuführen. Präfixieren Sie zunächst die Knochenscheiben zwei Stunden lang bei Raumtemperatur mit einem Milliliter 2,5% Glutaraldehyd pro Scheibe. Beschallen Sie die voreingestellten Scheiben dreimal für jeweils drei Minuten mit einem molaren Ammoniumhydroxid, um die Zellen zu entfernen.
Dann entfernen Sie das Ammoniumhydroxid und waschen Sie die Knochenscheiben dreimal mit PBS, wobei jede Wäsche 12 Minuten dauert. Fixieren Sie die gewaschenen Knochenscheiben mit 1%Osmsäure für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Führen Sie die Ethanolgradientendehydrierung wie im Textprotokoll beschrieben durch.
Danach das Ethanol für 15 Minuten durch Isoamylacetat ersetzen. Beschichten Sie die Scheiben mit Goldpalladium und analysieren Sie sie durch Rasterelektronenmikroskopie. In dieser Studie wurden eine große Anzahl von Osteoklast-Vorstufen isoliert, gereinigt und erfolgreich zu Osteoklasten induziert.
Durch die Ergänzung mit M-CSF und RANKL, Riesen-Osteoklasten werden an den Tagen fünf bis sechs gesehen. Die Bildung dieser Osteoklasten wird durch Fallenfärbung erfolgreich identifiziert. Große und violette Zellen gelten als TRAP-positive Zellen mit mehreren Kernen.
Durch diese Methode ist es typisch, 800 Osteoklasten mit bis zu 30 Kernen pro Osteoklast in einer 24-Well-Platte zu erhalten. Im Vergleich zur herkömmlichen Methode spart diese verbesserte Methode während des gesamten Isolationsprozesses ca. 20 Minuten. Die Verwendung von Knochenscheiben zur Beurteilung der Aktivität der Knochenresorption ist eine typische In-vitro-Methode.
Durch Toluidin-Blaufärbung wird der Resorptionsbereich als hellgrün visualisiert. Die Struktur und die Eigenschaften der Knochengruben können durch Rasterelektronenmikroskopie deutlich beobachtet werden. CTR, einer der Osteoklasten spezifischen Zellmarker, ist entscheidend, um Osteoklasten zu identifizieren und die Bildung von Osteoklasten im Knochen zu untersuchen.
Die positive Expression von CTR identifiziert eindeutig Osteoklasten und unterscheidet sie von Makrophagenpolykaryonen. CTR ist in den Immunfluoreszenz-Assays durch eine grüne Farbe deutlich angegeben, während das Blau die Zellkerne anzeigt. Achten Sie darauf, die Oberschenkelknochen und die Tibias nicht zu brechen, um knochenmarkzuvermeiden.
Eine Person, die diese Technik noch nie zuvor durchgeführt hat, kann Schwierigkeiten haben, wenn sie die Zellen Operation Lösung zu helfen. Die Pipettenspitze muss an der Innenfläche des Rohres befestigt und in einem 45-Grad-Winkel zur Innenfläche gehalten werden.
