שיטה זו היא משמעותית כי זה יכול לשמש כדי להשיג כמויות גדולות של osteoclasts מובחן לחלוטין במבחנה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא יציבה ובטוחה יותר ומבודדת את מח העצם בפחות זמן ועם פחות מאמצים בהשוואה להליך המסורתי. טכניקה זו יכולה לספק מקור יציב של osteoclasts, שהם האובייקט החשוב של מחלה מטבולית עצם, כולל אוסטאופורוזיס, parodontitis, אוסטאוליזה periprosthetic.
עם שינויים קלים, פרוטוקול זה יכול להיות מתאים גם להשגת סוגים שונים של מח עצם נגזר התאים חולדות או בעלי חיים אחרים. כדי להתחיל, מניחים בעלי חיים המתת חיטוי על לוח חיטוי בתנחה סופית. באמצעות מספריים סטריליים, לעשות חתך כ סנטימטר אחד אורך בעצם הירך proximal לקלף את העור.
לאחר מכן, לנתח את עצם הירך ואת השוקה. בזהירות ובעדינות, חותכים את חלקי החיבור הדו-צדדיים סביב מפרקי הירך, הברך והקרסוליים כדי לבודד את השוקיות ועצם הירך. חותכים חלק מהרקמות סביב העצם, מוודאים להיות יסודיים.
לאחר מכן, מניחים את העצמות ניקה לתוך צלחת עם חמישה מיליליטר של מדיום תרבות מלאה. השתמש במספריים סטריליים כדי לחתוך את העצם הארוכה. השתמש במחט מזרק מיליליטר אחד כדי לשטוף בזהירות את חלל מח העצם עם 10 מיליליטר של מדיה מלאה עד חלל מח העצם הופך לבן.
העבר את ההשעיה התא לצינור 50 מיליליטר ולסנן אותו עם מסננת 70 מיקרומטר כדי להסיר את הרקמה הנותרת. מוסיפים חמישה מיליליטר של חיץ תות דם אדום, ו דגירה התאים על קרח במשך שמונה דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים ב 250 פעמים G במשך חמש דקות כדי להניב את גלולת התא.
שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של מדיה מלאה. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים ולחשב את הזמן שהושקע בפעולות שננקטו עבור שיטה זו. ראשית, מניחים בעלי חיים המתת חיטוי על לוח חיטוי סופין.
באמצעות מספריים סטריליים, לעשות חתך כ סנטימטר אחד אורך בעצם הירך proximal לקלף את העור. לאחר מכן, לנתח את עצם הירך ואת השוקה. חותכים את החלקים של הרקמות סביב העצם, אם כי אין צורך להסיר את הרקמה לחלוטין.
לשטוף את השוקה ואת עצם הירך עם 12 מיליליטר של PBS, ולאחר מכן לחתוך אותם לחצי. מניחים את השוקיות חתוכים ואת עצם הירך לתוך קצה פיפטה אחד מיליליטר מוכן, וממקמים את זה לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה מוכן. צנטריפוגה הצינור שלוש פעמים ב 1, 000 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 45 שניות.
לאחר מכן, להסיר את קצה פיפטה המכיל את העצם מן הצינור, עוזב את מח העצם בצינור. הוסף 200 microliters של PBS לצינור, ואת פיפטה למעלה ולמטה שוב ושוב כדי לפורר את מח העצם ביסודיות. העבר את ההשעיה התא לצינור 50 מיליליטר, ולסנן אותו עם מסננת 70 מיקרומטר כדי להסיר את כל הרקמות הנותרות.
לאחר מכן, השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים וחשב את הזמן שהושקע בצעדים שננקטו בסעיף זה. הוסף שישה מיליליטר של פתרון הפרדת תאים לצינור צנטריפוגלי צנטריפוגלי מעופש סטרילי. מוסיפים את מתלי התאים המדוללים לצינור.
לאחר הוספת ההשעיה, תופיע מגבלה ברורה בין שכבת התאים לבין פתרון ההפרדה. לאחר מכן, לדבוק קצה פיפטה על פני השטח הפנימיים של הצינור בזווית של 45 מעלות. צנטריפוגה פתרון שכבתי בצנטריפוגה אופקית ב 500 פעמים G במשך 30 דקות.
לאחר מכן, שאף את השכבה השנייה המעוננת המכילה את תאי היעד מלמעלה למטה. העבר את תאי היעד לצינור חדש. הוסף חמישה מיליליטר של PBS לשטוף את התאים, צנטריפוגה ב 250 פעמים G במשך חמש דקות.
חזור על תהליך כביסה זה על ידי הוספת PBS וצנטריפוגה עבור סך של שלוש שטיפות. תן מחדש את גלולת התא עם מדיום אינדוקציה מח עצם. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים.
לאחר מכן, להוסיף חמישה עד שמונה מיליליטר של מח עצם אינדוקציה בינוני כדי להשיג פתרון תאים סופי של 300, 000 תאים למיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של פתרון תא זה לכל באר של צלחת 24 באר. לאחר הדגירה של התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות, בעדינות לשאוב את המדיום ולהוסיף מיליליטר אחד של מדיום אינדוקציה osteoclast לכל באר.
מתסיסים בעדינות את הצלחת ומחזירים אותה לאנקובטור. כל 48 שעות, להסיר ולהחליף 0.8 מיליליטר של מדיום אינדוקציה osteoclast מכל באר. מתסיסים את הצלחת בעדינות לפני החזרתה לאנקובטור.
כדי להתחיל בטיפול מקדים בפרוסות העצם, השתמשו במסור מיקרו חשמלי כדי לחתוך את קליפת המוח הטרייה של עצם הירך לשתי פרוסות עבות באורך שני סנטימטרים לאורך ציר האורך. לאחר חיתוך ושחזה את הפרוסות, לשטוף את הפרוסות על ידי טבילת אותם בתוך מקור של מים deionized וחשוף אותם אולטרסאונד ב 100 הרץ במשך שעה אחת. חזור על תהליך כביסה זה שלוש פעמים.
לטבול את הפרוסות שטף 75% אלכוהול במשך שעתיים. לאחר מכן, שאפו את האלכוהול וחשפו כל שקופית של פרוסות לאור אולטרה סגול למשך שעה על פלטפורמה נקייה. כדי להתחיל כתמים כחולים toluidine, מניחים את פרוסות העצם שטופלו מראש לתוך בארות של צלחת 24 היטב.
לאחר מכן, מוסיפים מדיום תרבות לתוך צלחת 24 גם לטבול את פרוסות העצם במשך שעתיים. צמח לגרום לתאים כפי שהודגם בעבר. לאחר osteoclasts הופיעו בארבעה עד שישה ימים, לשטוף את הפרוסות עם מיליליטר אחד של 0.25 אמוניום הידרוקסיד טוחן.
Sonicate את הפרוסות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד כדי להסיר את התאים החיים כדי לאפשר את הניתוח של בורות resorption על פרוסות העצם. לאחר מכן, להסיר את אמוניום הידרוקסיד ולהכתים את הפרוסות עם מיליליטר אחד של 1% פתרון כחול toluidine לכל פרוסה במשך שתי דקות. לשטוף את פרוסות הכתם עם PBS.
בחר באופן אקראי חמש תצוגות ולהשתמש בתוכנה לניתוח תמונה כדי לבצע ניתוח כמותי למחצה של אזור הטבילה מחדש. ראשית, קידומת את פרוסות העצם עם מיליליטר אחד של 2.5% glutaraldehyde לפרוסה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. Sonicate פרוסות קידומת שלוש פעמים במשך שלוש דקות כל אחד עם אמוניום הידרוקסיד טוחנת אחת כדי להסיר את התאים.
לאחר מכן, להסיר את אמוניום הידרוקסיד ולשטוף את פרוסות העצם שלוש פעמים עם PBS, עם כל לשטוף נמשך 12 דקות. תקן את פרוסות העצם השטופות בחומצה אוסמית של 1% למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. בצע התייבשות הדרגתית אתנול כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
לאחר מכן, להחליף את האתנול עם אצטט isoamyl במשך 15 דקות. מצפים את הפרוסות עם פלדיום זהב ולנתח אותם על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. במחקר זה, מספר גדול של מבשרי osteoclast היו מבודדים, מטוהרים ומושרה בהצלחה להיות osteoclasts.
על ידי שכשהם עם M-CSF ו RANKL, osteoclasts ענק נראים בימים חמש עד שש. היווצרותם של אוסטאוקלסטים אלה מזוהה בהצלחה על ידי כתמי מלכודת. תאים גדולים וסגולים נחשבים לתאים חיוביים TRAP עם גרעינים מרובים.
באמצעות שיטה זו, זה אופייני להשיג 800 osteoclasts המכילים רבים ככל 30 גרעינים לכל osteoclast בצלחת 24 גם. בהשוואה לשיטה המסורתית, שיטה משופרת זו חוסכת כ -20 דקות במהלך כל תהליך הבידוד. שימוש בפרוסות עצם כדי להעריך את הפעילות של התחדשות העצם היא שיטת במבחנה טיפוסית.
באמצעות כתמים כחולים טולואידין, אזור הטבילה מחדש הוא דמיינו כמו ירוק בהיר. המבנה והמאפיינים של בורות העצם ניתן לראות בבירור על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. CTR, אחד סמני התאים הספציפיים osteoclasts, הוא קריטי כדי לזהות osteoclasts וללמוד את היווצרות אוסטאוקלסטים בעצמות.
הביטוי החיובי של CTR מזהה בבירור אוסטאוקלסטים ומבדיל אותם מפוליקריונים מקרופאגים. CTR מצוין בבירור בנתונים immunofluorescence על ידי צבע ירוק, בעוד הכחול מציין את גרעיני התא. הקפד לא לשבור את עצם הירך ואת השוקה כדי למנוע אובדן מח עצם.
אדם שמעולם לא ביצע טכניקה זו בעבר עשוי להיאבק בעת סיוע לפתרון פעולת התאים. קצה פיפטה חייב להיות דבק על פני השטח הפנימיים של הצינור נשמר בזווית של 45 מעלות אל פני השטח הפנימיים.
