Bu yöntem, tam diferansiye osteoklastlar in vitro büyük miktarlarda elde etmek için kullanılabilir, çünkü önemlidir. Bu yöntemin en büyük avantajı, daha kararlı ve güvenli olması ve kemik iliği izole daha kısa sürede ve daha az çaba ile geleneksel işlem göre. Bu teknik osteoporoz, parodontit ve periprotez osteoliz gibi kemik metabolik hastalığın önemli nesnesi olan osteoklastlar, istikrarlı bir kaynak sağlayabilir.
Küçük değişiklikler ile, bu protokol aynı zamanda kemik iliği sıçan veya diğer hayvanlarda hücreleri elde çeşitli elde etmek için uygun olabilir. Başlamak için, bir supine pozisyonda dezenfekte tahtası üzerinde ötenazi hayvanları yerleştirin. Steril makas kullanarak, cildi soymak için proksimal femur uzunluğu yaklaşık bir santimetre bir kesi yapmak.
Sonra, uyluk ve tibias dışarı incelemek. Dikkatle ve nazikçe, tibias ve femurlar izole etmek için kalça, diz ve ayak bileği eklemleri etrafında ikili bağlantı parçaları kesti. Kemik çevresindeki dokuların bir kısmını kesin olarak kesin.
Sonra, tam kültür orta beş mililitre ile bir çanak içine temizlenmiş kemikleri yerleştirin. Uzun kemiği kesmek için steril makas kullanın. Ilik boşluğu beyaza dönene kadar 10 mililitre lik tam ortamla ilik boşluğunu dikkatlice yıkamak için bir mililitrelik şırınga iğnesi kullanın.
Bu hücre süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve kalan dokuyu çıkarmak için 70 mikrometrelik bir süzgeçle filtreleyin. Beş mililitre kırmızı kan lisis tamponu ekleyin ve hücreleri sekiz dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, hücre pelet verimi için beş dakika boyunca 250 kez G hücreleri santrifüj.
Supernatant aspire ve tam medya 10 mililitre hücreleri resuspend. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın ve bu yöntem için yapılan eylemler için harcanan zamanı hesaplayın. İlk olarak, bir supine pozisyonda dezenfekte tahtası üzerinde ötenazi hayvanlar yerleştirin.
Steril makas kullanarak, cildi soymak için proksimal femur uzunluğu yaklaşık bir santimetre bir kesi yapmak. Sonra, uyluk ve tibias dışarı incelemek. Tamamen doku kaldırmak için gerek olmamasına rağmen, kemik çevresindeki dokuların parçaları kesin.
Tibias ve uyluk kemiğini 12 mililitre PBS ile durulayın ve sonra ikiye bölün. Hazırlanan bir mililitre pipet ucu içine snipped tibias ve femurlar yerleştirin ve hazırlanmış bir mikro santrifüj tüp içine yerleştirin. Tüpü 1,000 kez G'de üç kez ve 45 saniye boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin.
Bundan sonra, kemik içeren pipet ucunu tüpten çıkarın ve kemik iliğini tüpte bırakın. Tüpe 200 mikrolitre PBS ekleyin ve iliği iyice parçalamak için tekrar tekrar yukarı pipet ekleyin. Bu hücre süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve kalan dokuları çıkarmak için 70 mikrometrelik bir süzgeçle filtreleyin.
Ardından, hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın ve bu bölümde atılan adımlarda harcanan zamanı hesaplayın. Steril silikize santrifüj tüpüne altı mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Tüpe seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin.
Süspansiyon ekledikten sonra, hücre tabakası ve ayırma çözümü arasında net bir sınır görünür. Daha sonra, 45 derecelik bir açıyla tüpün iç yüzeyine bir pipet ucu yapıştırın. Katmanlı çözeltiyi yatay bir santrifüjde 500 kez G'de 30 dakika santrifüj edin.
Bundan sonra, yukarıdan aşağıya hedef hücreleri içeren bulutlu ikinci tabaka aspire. Hedef hücreleri yeni bir tüpe aktarın. Hücreleri yıkamak için beş mililitre PBS ekleyin ve beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüj.
Toplam üç yıkama için PBS ve santrifüj ekleyerek bu yıkama işlemini tekrarlayın. Kemik iliği indüksiyon orta ile hücre pelet resuspend. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın.
Daha sonra, mililitre başına 300, 000 hücrelik nihai bir hücre çözümü elde etmek için kemik iliği indüksiyon ortamı beş ila sekiz mililitre ekleyin. 24 kuyu plakaher kuyuya bu hücre çözeltisi bir mililitre ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yattıktan sonra, hafifçe orta kapalı aspire ve her kuyuya osteoklast indüksiyon ortamı bir mililitre ekleyin.
Yavaşça plakayı çalkalayın ve kuvöze geri dönün. Her 48 saatte bir, her kuyudan 0.8 mililitre osteoklast indüksiyon ortamını çıkarın ve değiştirin. Kuvöze geri vermeden önce tabağı hafifçe çalkalayın.
Kemik dilimleri nin ön tedavisine başlamak için, taze büyükbaş femoral kemik korteksini uzunlamasına eksen boyunca iki santimetre kalınlığında dilimler halinde kesmek için mikro elektrikli testere kullanın. Dilimleri kesip öğüttükten sonra, dilimleri deiyonize su kabına batırarak ve 100 hertz'de bir saat ultrasona tabi tutarak yıkayın. Bu yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.
Yıkanmış dilimleri iki saat boyunca %75 alkole batırın. Daha sonra, alkol kapalı aspire ve temiz bir platformda bir saat boyunca ultraviyole ışığa dilim her slayt maruz. Toluidin mavi boyama başlamak için, 24 kuyu plaka kuyuları içine önceden işlenmiş kemik dilimleri yerleştirin.
Bundan sonra, iki saat boyunca kemik dilimleri batırmak için 24 iyi plaka içine kültür ortamı ekleyin. Bitki ve daha önce gösterildiği gibi hücreleri indüklemek. Osteoklastlar dört ila altı gün çıktıktan sonra, 0.25 molar amonyum hidroksit bir mililitre ile dilimleri yıkayın.
Yaşayan hücreleri çıkarmak ve kemik dilimleri üzerindeki rezorpsiyon çukurlarının analizine izin vermek için dilimleri beş dakika boyunca üç kez sonicate. Daha sonra, amonyum hidroksit çıkarın ve iki dakika boyunca dilim başına% 1 toluidin mavi çözeltibir mililitre ile dilimleke. Leke dilimlerini PBS ile yıkayın.
Rasgele beş görünüm seçin ve rezorpsiyon alanının yarı nicel analizini gerçekleştirmek için bir görüntü analizi yazılımı kullanın. İlk olarak, oda sıcaklığında iki saat boyunca dilim başına%2.5 glutaraldehit bir mililitre ile kemik dilimleri önek. Hücreleri kaldırmak için bir molar amonyum hidroksit ile üç dakika boyunca üç kez önceden sabitlenmiş dilimleri sonicate.
Daha sonra amonyum hidroksiti çıkarın ve kemik dilimlerini PBS ile üç kez yıkayın ve her yıkama 12 dakika sürsin. Yıkanmış kemik dilimlerini oda sıcaklığında iki saat boyunca %1 osmik asitle sabitleyin. Metin protokolünde belirtildiği gibi etanol gradyan dehidratasyon gerçekleştirin.
Bundan sonra, 15 dakika boyunca isoamyl asetat ile etanol değiştirin. Altın paladyum ile dilimkat ve elektron mikroskobu tarama ile analiz. Bu çalışmada, osteoklast öncüleri çok sayıda izole edildi, saflaştırılmış ve başarılı osteoklastlar olmak için indüklenen.
M-CSF ve RANKL ile takviye ederek, dev osteoklastlar gün beş ila altı görülür. Bu osteoklastların oluşumu tuzak boyama ile başarıyla tanımlanır. Büyük ve mor hücreler birden fazla çekirdekli TRAP pozitif hücreler olarak kabul edilir.
Bu yöntem sayesinde, 24 iyi plaka osteoklast başına 30 çekirdek kadar içeren 800 osteoklast elde etmek için tipiktir. Geleneksel yöntemle karşılaştırıldığında, bu geliştirilmiş yöntem tüm yalıtım işlemi sırasında yaklaşık 20 dakika tasarruf sağlar. Kemik rezorpsiyon aktivitesini değerlendirmek için kemik dilimleri kullanarak tipik bir in vitro yöntemdir.
Toluidin mavi boyama sayesinde, rezorpsiyon alanı açık yeşil olarak görselleştirilmiş. Kemik çukurlarının yapısı ve özellikleri elektron mikroskobu taranarak açıkça görülebilir. TO, osteoklastlar belirli hücre belirteçleri biri, osteoklastlar tanımlamak ve kemik osteoklastoluşumunu incelemek için önemlidir.
TO'nun pozitif ekspresyonu osteoklastları açıkça tanımlar ve makrofaj polikaryonlardan ayırır. TO, immünoforesans tahlillerinde yeşil renkle açıkça gösterilirken, mavi hücre çekirdeğini gösterir. Kemik iliği kaybetmemek için uyluk kemiği ve tibias kırık değil emin olun.
Bu tekniği daha önce hiç yapmamış bir birey, hücre operasyon çözümüne yardımcı olurken mücadele edebilir. Pipet ucu tüpün iç yüzeyine yapıştırılmalı ve iç yüzeye 45 derecelik açıyla tutulmalıdır.
