Questo metodo è significativo perché può essere utilizzato per ottenere grandi quantità di osteoclasti completamente differenziati in vitro. Il vantaggio principale di questo metodo è che è più stabile e sicuro e isola il midollo osseo in meno tempo e con meno sforzi rispetto al procedimento tradizionale. Questa tecnica può fornire una fonte stabile di osteoclasti, che sono l'importante oggetto della malattia metabolica ossea, tra cui osteoporosi, parodontite e osteolisi periprotesica.
Con piccole modifiche, questo protocollo può anche essere appropriato per ottenere vari tipi di midollo osseo derivato dalle cellule nei ratti o in altri animali. Per iniziare, posizionare gli animali eutanasiati su una tavola disinfettata in posizione supina. Usando forbici sterili, fare un'incisione lunga circa un centimetro al femore prossimale per sbucciare la pelle.
Quindi, seziona i femminicidi e le tibia. Con attenzione e delicatezza, tagliare le parti di connessione bilaterali intorno all'anca, al ginocchio e alle articolazioni della caviglia per isolare le tibia e i femminicidi. Tagliare parte dei tessuti intorno all'osso, assicurandosi di essere accurati.
Quindi, posizionare le ossa pulite in un piatto con cinque millilitri di mezzo di coltura completo. Usa forbici sterili per tagliare l'osso lungo. Utilizzare un ago per siringhe millilitro per sciacquare con cura la cavità del midollo con 10 millilitri di mezzi completi fino a quando la cavità del midollo diventa bianca.
Trasferire questa sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri e filtrarla con un filtro da 70 micrometri per rimuovere il tessuto rimanente. Aggiungere cinque millilitri di tampone di lisi del sangue rosso e incubare le cellule sul ghiaccio per otto minuti. Successivamente, centrifugare le cellule a 250 volte G per cinque minuti per produrre il pellet cellulare.
Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in 10 millilitri di mezzi completi. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule e calcolare il tempo dedicato alle azioni intraprese per questo metodo. In primo luogo, posizionare gli animali eutanasiati su una tavola disinfettata in posizione supina.
Usando forbici sterili, fare un'incisione lunga circa un centimetro al femore prossimale per sbucciare la pelle. Quindi, seziona i femminicidi e le tibia. Tagliare le parti dei tessuti intorno all'osso, anche se non è necessario rimuovere completamente il tessuto.
Risciacquare le tibia e i femori con 12 millilitri di PBS, quindi tagliarli a metà. Posizionare le tibia e i femminicidi stronchiti in una punta di pipetta da millilitro preparata e posizionarlo in un tubo di micro centrifuga preparato. Centrifugare il tubo tre volte a 1.000 volte G e a quattro gradi Celsius per 45 secondi.
Successivamente, rimuovere la punta della pipetta contenente l'osso dal tubo, lasciando il midollo osseo nel tubo. Aggiungere 200 microlitri di PBS al tubo e pipettare ripetutamente su e giù per disintegrare accuratamente il midollo. Trasferire questa sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri e filtrarla con un filtro da 70 micrometri per rimuovere i tessuti rimanenti.
Quindi, usa un emocitometro per contare le cellule e calcola il tempo trascorso sui passaggi presi in questa sezione. Aggiungere sei millilitri di soluzione di separazione cellulare a un tubo centrifugo silicificato sterile. Aggiungere la sospensione cellulare diluita al tubo.
Dopo aver aggiunto la sospensione, apparirà un chiaro limite tra lo strato di celle e la soluzione di separazione. Quindi, aderire a una punta di pipetta alla superficie interna del tubo con un angolo di 45 gradi. Centrifugare la soluzione stratificata in una centrifuga orizzontale a 500 volte G per 30 minuti.
Successivamente, aspirare il secondo livello torbido che contiene le celle di destinazione dall'alto verso il basso. Trasferire le celle di destinazione in un nuovo tubo. Aggiungere cinque millilitri di PBS per lavare le cellule e centrifugare a 250 volte G per cinque minuti.
Ripetere questo processo di lavaggio aggiungendo PBS e centrifugando per un totale di tre lavaggi. Rimossare il pellet cellulare con mezzo di induzione del midollo osseo. Usa un emocitometro per contare le cellule.
Quindi, aggiungere da cinque a otto millilitri di mezzo di induzione del midollo osseo per ottenere una soluzione di cellule finali di 300.000 cellule per millilitro. Aggiungere un millilitro di questa soluzione cellulare ad ogni pozzetto di una piastra di 24 pozzetto. Dopo aver incubato le cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore, aspirare delicatamente il mezzo e aggiungere un millilitro di mezzo di induzione osteoclasta ad ogni pozzo.
Agitare delicatamente la piastra e restituirla all'incubatrice. Ogni 48 ore, rimuovere e sostituire 0,8 millilitri di mezzo di induzione osteoclasta da ogni pozzo. Agitare delicatamente la piastra prima di restituirla all'incubatrice.
Per iniziare a pretrattare le fette ossee, utilizzare una sega micro elettrica per tagliare la corteccia ossea femorale bovina fresca in fette spesse due centimetri lungo l'asse longitudinale. Dopo aver tagliato e macinato le fette, lavare le fette immergendole in un bicchiere di acqua deionizzata e sottometterli ad ultrasuoni a 100 hertz per un'ora. Ripetere questo processo di lavaggio tre volte.
Immergere le fette lavate con 75% di alcol per due ore. Quindi, aspirare l'alcol ed esporre ogni diapositiva di fette alla luce ultravioletta per un'ora su una piattaforma pulita. Per iniziare la colorazione blu toluidina, posizionare le fette ossee pretrattate nei pozzi della piastra del pozzo 24.
Successivamente, aggiungere il mezzo di coltura nel piatto di 24 po 'per immergere le fette ossee per due ore. Piantare e indurre le cellule come dimostrato in precedenza. Dopo che gli osteoclasti sono apparsi a quattro o sei giorni, lavare le fette con un millilitro di idrossido di ammonio molare 0,25.
Sonicare le fette tre volte per cinque minuti ciascuna per rimuovere le cellule viventi e consentire l'analisi delle fosse di riassorbimento sulle fette ossee. Quindi, rimuovere l'idrossido di ammonio e macchiare le fette con un millilitro di soluzione blu di toluidina all'1% per fetta per due minuti. Lavare le fette di macchia con PBS.
Selezionare casualmente cinque viste e utilizzare un software di analisi delle immagini per eseguire un'analisi semi-quantitativa dell'area di riassorbimento. In primo luogo, antescere le fette ossee con un millilitro del 2,5% di glutaraldeide per fetta per due ore a temperatura ambiente. Sonicare le fette prefissate tre volte per tre minuti ciascuna con un idrossido di ammonio molare per rimuovere le cellule.
Quindi, rimuovere l'idrossido di ammonio e lavare le fette ossee tre volte con PBS, con ogni lavaggio della durata di 12 minuti. Fissare le fette ossee lavate con acido osmico all'1% per due ore a temperatura ambiente. Eseguire la disidratazione del gradiente di etanolo come descritto nel protocollo di testo.
Dopo questo, sostituire l'etanolo con acetato di isoamile per 15 minuti. Rivestire le fette con palladio d'oro e analizzarle scansionando la microscopia elettronica. In questo studio, un gran numero di precursori dell'osteoclasta sono stati isolati, purificati e indotti con successo a diventare osteoclasti.
Integrandosi con M-CSF e RANKL, gli osteoclasti giganti sono visti nei giorni da cinque a sei. La formazione di questi osteoclasti è identificata con successo dalla colorazione delle trappole. Le cellule grandi e viola sono considerate cellule positive TRAP con nuclei multipli.
Attraverso questo metodo, è tipico ottenere 800 osteoclasti contenenti fino a 30 nuclei per osteoclasta in una piastra di 24 pozza. Rispetto al metodo tradizionale, questo metodo migliorato consente di risparmiare circa 20 minuti durante l'intero processo di isolamento. L'uso di fette ossee per valutare l'attività del riassorbimento osseo è un metodo tipico in vitro.
Attraverso la colorazione blu toluidina, l'area di riassorbimento viene visualizzato come verde chiaro. La struttura e le caratteristiche delle fosse ossee possono essere chiaramente osservate mediante microscopia elettronica a scansione. Il CTR, uno dei marcatori cellulari specifici degli osteoclasti, è fondamentale per identificare gli osteoclasti e studiare la formazione di osteoclasti nell'osso.
L'espressione positiva del CTR identifica chiaramente gli osteoclasti e li distingue dai policariosi macrofagi. Il CTR è chiaramente indicato nei saggi di immunofluorescenza da un colore verde, mentre il blu indica i nuclei cellulari. Assicurarsi di non fratturare i femore e le tibia per evitare di perdere il midollo osseo.
Un individuo che non ha mai eseguito questa tecnica prima può avere difficoltà quando aiuta la soluzione operativa delle cellule. La punta della pipetta deve essere aderì alla superficie interna del tubo e mantenuta con un angolo di 45 gradi rispetto alla superficie interna.
