Nuestros datos demuestran que la inhibición transitoria de la actividad rho-quinasa mejora la adhesión, la supervivencia y el injerto de cardiomiocitos derivados de hiPSC después de ser trasplantados en los corazones animales infartos. Proporcionamos un método simple, de bajo costo, mientras que altamente eficiente para aumentar el injerto de cardiomiocitos derivados de hiPSC trasplantados en los corazones de los animales lesionados. Como esta técnica puede mejorar las tasas de injerto celular de forma segura y eficiente en el infarto cardíaco agudo y la insuficiencia cardíaca, contribuye a las mejoras resultantes en la función cardíaca, vasculares, y apoptosis.
Aunque sólo probamos nuestros protocolos en hiPSC, estos métodos se pueden aplicar a otros tipos de células, como células madre embrionarias, células madre mesenquimales, etc. La dosis y la duración del tratamiento con Y-27632 son fundamentales. La demostración visual puede demostrar con gran detalle todos los pasos clave en el protocolo, lo que es beneficioso para alguien que nunca ha realizado esta técnica antes.
El día 21 después de la diferenciación hiPSC-CM, aspirar el medio y lavar las células con PBS estéril una vez. Incubar las células con 0,5 mililitros de enzimas de disociación celular por pozo a 37 grados centígrados durante cinco a siete minutos. Después del tiempo de incubación, pipetee repetidamente la suspensión celular utilizando una pipeta de un mililitro para disociar a fondo las células.
Luego, agregue un mililitro de solución neutralizante a cada pozo, recoja la mezcla celular en un tubo centrífuga de 15 mililitros y centrífuga a 200 veces g durante tres minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y resusppend las células en la solución neutralizante. Luego, replantar las células en placas recubiertas de gelatina de seis pozos a una densidad de dos millones de células por pozo.
Después de 24 a 48 horas, sustituya el medio de cultivo por el medio de purificación durante tres a cinco días. Antes del trasplante, cultivar las células en el grupo de tratamiento durante 12 horas en el medio RB-plus complementado con 10 micromolares Y-27632. Del mismo modo, realizar el tratamiento con verapamilo en las células del medio RB-plus con una micromole de verapamilo durante 12 horas.
Después del tratamiento, lave los hiPSC-CM con PBS una vez e incubar las células con 0,5 microlitros de enzimas de disociación celular por pozo durante un máximo de dos minutos. Pipetear repetidamente la suspensión celular utilizando una pipeta de un mililitro para disociar completamente las células. A continuación, neutralizar las células con solución neutralizante, recoger la mezcla celular en un tubo centrífugo de 15 mililitros y centrífuga a 200 veces g durante tres minutos.
Después de la centrifugación, resuspender las células en PBS a una concentración de 0,1 millones de células por cinco microlitros en preparación para la inyección. Inmediatamente después de la inducción de infarto de miocardio, inyectar cinco microlitros de control hiPSC-CM, hiPSC-CM pretratadoS Y-27632, hiPSC-CM tratados con verapamil, o un volumen igual de PBS en el miocardio del ratón en cada sitio, uno en el área de infarto y dos en las áreas alrededor del infarto. 12 horas antes de realizar la detección transitoria y de contractilidad de calcio, agregue 10 micromolares Y-27632, RA nanomolar, verapamilo de un micromolar o un volumen igual de PBS en el medio de cultivo de hiPSC-CM.
A continuación, deseche el medio y lave la placa con PBS una vez. Cambie el medio a un DMEM libre de rojo fenol que contenga 0.02 peso por volumen por porcentaje de poliol tensioactivo, indicador de calcio cinco-micromolar, y el correspondiente Y-27632, RA, verapamilo, o un volumen igual de PBS, e incubar la placa a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de la incubación, deseche el sobrenadante, lave las células con el DMEM libre de tinte tres veces y deje reposar el medio durante 30 minutos para desestimerizar el tinte cartográfico.
Coloque el cubreobjetos de semilla de célula en una cámara de baño abierta e inserte la cámara en un sistema de microincubina equilibrado a 37 grados Celsius con un controlador automático de temperatura. Perdague con la solución de Tyrode y agregue continuamente RI, RA o PBS a la solución de perfusión. Utilice un microscopio de fluorescencia invertido y un cabezal de escaneo láser para registrar el transitorio espontáneo de calcio mediante el uso de un escaneo de línea x-t.
Registre la contracción espontánea de hiPSC-CM utilizando la funcionalidad de contraste de interferencia diferencial del microscopio confocal. La tasa de supervivencia de las células trasplantadas fue confirmada por el aumento de la actividad luciferasa. El aumento de la troponina cardiaca humana T y la expresión de antígeno nuclear humano mostraron que el pretratamiento Y-27632 podría mejorar significativamente la tasa de injerto celular.
Las células pretratadas Y-27632 presentaban una estructura citoesquelética más grande y definida en forma de varilla. Además, el pretratamiento Y-27632 disminuyó las células tuNEL positivas, lo que indica la reducción de la apoptosis hiPSC-CM trasplantada in vivo. Western blot sugirió que el pretratamiento Y-27632 aumentó la expresión de integrina beta-1 y N-cadherina y disminuyó la expresión de la cadena de luz fosfo-miosina 2.
Este cambio se normalizó 72 horas después de la retirada de Y-27632. Los experimentos de unión celular HL-1 del ratón in vitro indicaron que el pretratamiento Y-27632 aumentó significativamente la adherencia de hiPSC-CM en relación con hl-1. El pretratamiento Y-27632 redujo la fuerza contráctil, la fluorescencia transitoria de calcio pico y la duración transitoria del calcio.
La contracción cardiomiocitos regulada por pretratamiento Y-27632 redujo significativamente la expresión de cTnI y cTnT. Al igual que Y-27632, el pretratamiento verapamilo aumentó la actividad de la luciferasa y el número de células de hcTnT/HNA doble positiva. El paso más importante es cultivar células en el grupo de tratamiento durante 12 horas en el medio Rb-plus complementado con 10 micromolares Y-27632.
Basado en este método, la liberación lenta de Y-27632 para aumentar aún más la tasa de injerto celular es una estrategia prometedora. Esta técnica allana el camino para que los investigadores estudien la fisiología y la función de hiPSC de LOS CM in vivo. La molécula pequeña CHIR99021 utilizada para la diferenciación de cardiomiocitos es peligrosa, lo que puede causar irritación respiratoria.
Por favor, no inhale ni inhale de ninguna manera.
