Se han sugerido cruces de brechas como objetivos de drogas. El ensayo Iodide-YFP-GJIC es compatible con el cribado de alto rendimiento para descubrir moduladores de unión de brechas. Se ha utilizado para probar los efectos de un gran número de compuestos en las actividades de unión de brecha en un período relativamente corto.
El ensayo Iodide-YFP-GJIC es simple, robusto, repetible y económico. Este ensayo solo requiere células de aceptación y donante y dos soluciones salinas equilibradas. No se necesitan reactivos adicionales como Lucifer amarillo y Calcein AM.
También mide las actividades de unión de brecha total de las células en un solo pozo, lo que resulta en una baja variabilidad entre pozos. Para comenzar este procedimiento, las células LN215 crecen al 80% de confluencia en DMEM suplementado como se describe en el protocolo de texto. Un día antes de la transducción lavar las células dos veces con 10 mililitros de PBS.
Añadir dos mililitros de 0.25%trypsin EDTA a las células e incubar a 37 grados Celsius durante tres minutos. Usando una pipeta serológica de 10 mililitros resuspendió las células en cinco mililitros de medio de cultivo y ajustar la densidad celular a 50.000 células por mililitro. Agregue 400 microlitros de medios que contengan 20.000 células a cada pozo de una placa de cultivo de 24 pozos.
Incubar a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente transducir dos pozos reemplazando el medio de cultivo por 400 microlitros de una mezcla uno a uno de un lentivirus y medio de cultivo fresco complementado con polibrena a una concentración final de cuatro microgramos por mililitro. Para los controles sin virus reemplazar el medio de cultivo con medio de cultivo fresco complementado con polibrena a una concentración final de cuatro microgramos por mililitro.
Incubar a 37 grados centígrados durante 15 horas. A continuación, aspirar el medio que contiene lentivirus, y medio de cultivo fresco. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 72 horas adicionales.
Después de esto, lavar las células en cada pozo dos veces con 0.5 mililitros de PBS. Añadir 300 microlitros de 0.25%trypsin EDTA a las células, e incubar a 37 grados Celsius durante tres minutos. Resuspender las células en dos mililitros de medio de cultivo, y luego placarlas en placas de cultivo de seis pozos con dos microgramos por mililitro de puromicina.
Cultivo de las células hasta que todas las células de los pozos de control están muertas, lo que suele tardar aproximadamente una semana. En primer lugar, cultivo por separado LN215-YFP y LN215-células de yoduro en placas de 100 milímetros en medio de cultivo para llegar a las poblaciones requeridas para el ensayo. Un día antes del ensayo, lave cada plato con 10 mililitros de PBS.
Tratar cada plato con dos mililitros de 0.25% de solución de trypsin EDTA, e incubar a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Resuspender las células en cuatro mililitros de medio de cultivo y transferirlas a tubos cónicos de 15 mililitros. Centrifugar a 1.000 g durante tres minutos para peletizar las células.
Deseche el sobrenadante y resusppend cada pellet celular en cinco mililitros de medio de cultivo. Pipetear hacia arriba y hacia abajo unas 20 veces para romper cualquier grupo de células. Usa un hemocitoómetro para contar las células.
Y luego diluir las células en medio de cultivo para hacer la suspensión celular en las densidades que se muestran aquí. A continuación, mezcle siete mililitros de cada suspensión celular en un depósito. Utilice una pipeta multicanal para añadir 100 microlitros de esta mezcla a cada pozo de una placa de cultivo de 96 pozos.
Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. En primer lugar, utilice un microscopio de fluorescencia con aumento de 20X y un filtro GFP para comprobar las placas de 96 pozos para asegurarse de que no hay grumos de células, y que los cultivos están completamente confluentes y bien distribuidos. Al menos 30 minutos antes del ensayo, encienda un lector de microplacas y establézcalo en 37 grados centígrados.
Lave el tubo de un inyector automatizado con tres mililitros de 70%etanol, tres mililitros de agua destilada y tres mililitros de solución I. A continuación, caliente las soluciones C e I a 37 grados Celsius en un baño de agua. Aspirar el medio de crecimiento o invertir la placa para vaciarla.
Toque cualquier medio residual. A continuación, añada la solución C a un depósito utilizando una pipeta multicanal para añadir 200 microlitros de solución C a cada pozo de la placa. Aspirar la solución o invertir la placa para vaciarla, por lo que se debe aprovechar cualquier solución residual.
Agregue 50 microlitros de solución C a cada pozo. A continuación, agregue un microlitro de un stock químico de 2,5 mililitros o DMSO como vehículo, y agregue otros 50 microlitros de solución C a cada pozo. Incubar las células a 37 grados centígrados en el aire durante aproximadamente 10 minutos.
Durante la incubación, comience a establecer los parámetros en el programa de lector de microplacas haciendo clic en el botón Administrar protocolos. Haga clic en el botón Nuevo. Seleccione la Intensidad de fluorescencia en la sección Método de medición y El modo de pozo en la sección Modo de lectura.
A continuación, haga clic en el botón Aceptar. Aparecerá una nueva pestaña. En el menú Parámetros básicos, establezca la longitud de onda Excitación en 485 nanómetros y la Emisión en 520 nanómetros.
Seleccione la óptica inferior para leer la fluorescencia desde la parte inferior. A continuación, establezca el tiempo de inicio de la medición en cero segundos, el número de intervalos para ser 25, el número de destellos por pozo y el intervalo para ser 20, y el tiempo de intervalo para ser 0,4 segundos. En el menú Diseño, dibuje una región de la placa que se va a leer.
En el menú Concentraciones/Volumen/Shacking, configure el lector de microplacas para inyectar 100 microlitros de I-solution a cada pocólite con una velocidad de inyección de 135 microlitros por segundo. En el menú Tiempo de inyección, establezca la hora de inicio de la inyección en un segundo. A continuación, haga clic en el botón Iniciar medición.
Una vez completada la incubación, transfiera las placas de 96 pocillos al lector de microplacas e inicie la medición haciendo clic de nuevo en el botón Iniciar medición. En este estudio, el ensayo de comunicación intercelular/unión de proteína fluorescente de yodo-amarillo-brecha se utiliza con células LN215-YFP y LN215-yodo para examinar 2.320 productos químicos para identificar nuevos moduladores de comunicación intracelular de unión de brecha. Se observa que Homosalate inhibe el 50% de la comunicación intracelular de unión de la brecha.
Mientras que la terbinafina completamente lo inhibe. Esto confirma la terbinafina como un inhibidor de la unión de la brecha. Este ensayo mide el GJIC entre las células vecinas del donante y del aceptador, por lo que las células donantes y receptoras deben disociarse completamente antes del enchapado.
Y la confluencia del cultivo mixto debe ser del 100% para maximizar la formación de las uniones de separación entre las células. Los datos del curso de tiempo, las relaciones de respuesta a la dosis y la evaluación de la reversibilidad de los moduladores de unión de brecha se pueden obtener con el ensayo Iodide-YFP-GJIC. Además, se pueden establecer ensayos específicos de connexina GJIC de yoduro-YFP induciendo la expresión de una connexina de interés en las células desprovistas de uniones de brecha funcional.
Esto permite determinar el valor IC50 de un producto químico de un tipo específico de connexina. El ensayo Iodide-YFP-GJIC se puede utilizar para la detección de alto rendimiento, ya que es robusto, repetible y económico. Este ensayo ayuda a encontrar sustancias químicas moduladoras de la unión de brechas para el descubrimiento de fármacos y la evaluación toxicológica.
