ギャップジャンクションは、薬物標的として示唆されている。ヨウ化 -YFP-GJIC アッセイは、ギャップ接合変調器を発見するためのハイスループットスクリーニングと互換性があります。これは、比較的短い期間にギャップ接合活動に対する多数の化合物の影響をテストするために使用されています。
ヨウ化 -YFP-GJIC アッセイは、シンプルで堅牢で、再現性が高く、安価です。このアッセイは、アクセクサ細胞とドナー細胞と2つのバランスのとれた塩溶液のみを必要とする。ルシファーイエローやカルセインAMなどの追加試薬は必要ありません。
また、単一のウェル内の細胞の総ギャップ接合活動を測定し、その結果、ウェル間の変動性が低くなります。この手順を開始するには、テキスト プロトコルで概説されているように、補足 DMEM で LN215 細胞を 80% のコンフルエンシーに成長させます。1日の伝達は、PBSの10ミリリットルで細胞を2回洗浄します。
0.25%トリプシンEDTAの2ミリリットルを細胞に加え、37°Cで3分間インキュベートします。10ミリリットル血清学的ピペットを用いて、5ミリリットルの培養培地で細胞を再懸濁し、細胞密度を1ミリリットル当たり50,000細胞に調整する。24ウェル培養プレートの各ウェルに20,000個の細胞を含む400マイクロリットルの培地を加えます。
摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、培養培地を、1ミリリットル当たり4マイクログラムの最終濃度でポリブレンを添加したレンチウイルスと新鮮な培養培地の1対1の混合物の400マイクロリットルに置き換えることによって、2つの井戸を切り替える。ウイルス制御なしについては、培養培地を、1ミリリットル当たり4マイクログラムの最終濃度でポリブレンを補充した新鮮な培養培地に置き換える。
摂氏37度で15時間インキュベートします。次いでレンチウイルスを含む培地を吸引し、新鮮な培養培地を用いた。さらに72時間、摂氏37度で細胞をインキュベートします。
この後、各ウェルの細胞を0.5ミリリットルのPBSで2回洗います。0.25%トリプシンEDTAの300マイクロリットルを細胞に加え、37°Cで3分間インキュベートします。培養培地の2ミリリットルで細胞を再懸濁し、ピューロマイシンの1ミリリットル当たり2マイクログラムの6ウェル培養プレートにプレートします。
コントロールウェル内のすべての細胞が死ぬまで細胞を培養し、通常は約1週間かかります。まず、LN215-YFPおよびLN215-ヨウ化細胞を培地中の100ミリメートルプレートに分けて培養し、アッセイに必要な集団に到達する。アッセイの1日前に、各プレートを10ミリリットルのPBSで洗います。
0.25%トリプシンEDTA溶液の2ミリリットルで各プレートを扱い、5分間摂氏37度でインキュベートします。培養培地の4ミリリットルに細胞を再懸濁し、15ミリリットルの円錐管に移す。遠心分離機を1,000gで3分間ペレットし、細胞をペレット化する。
上清を捨て、各細胞ペレットを5ミリリットルの培養培地で再懸濁する。ピペットは、任意の細胞の塊を分割するために約20回上下します。細胞を数えるために、ヘモサイトメーターを使用してください。
そして、培養培地中の細胞を希釈して、ここに示す密度で細胞懸濁液を作る。次に、各細胞懸濁液の7ミリリットルを貯留槽に混ぜ合わせます。マルチチャンネルピペットを使用して、この混合物の100マイクロリットルを96ウェル培養プレートの各ウェルに追加します。
24時間5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベート。まず、20倍倍の蛍光顕微鏡とGFPフィルターを使用して96ウェルプレートをチェックし、細胞の塊がなく、培養物が完全にコンフルで十分に分布していることを確認します。アッセイの少なくとも30分前にマイクロプレートリーダーをオンにし、摂氏37度に設定します。
自動化インジェクターのチューブを、70%エタノールの3ミリリットル、蒸留水3ミリリットル、I溶液3ミリリットルで洗浄します。次に、水浴でCとI溶液を摂氏37度に温めます。成長培地を吸引するか、プレートを反転して空にします。
残差媒体をタップします。次に、マルチチャンネルピペットを使用してC溶液をリザーバに加え、プレートの各ウェルに200マイクロリットルのC溶液を加えます。溶液を吸引するか、プレートを反転させて空にし、残留溶液をタップします。
各ウェルに50マイクロリットルのC溶液を加えます。その後、2.5ミリモルの化学ストックまたはDMSOのいずれかを車両として1マイクロリットル加え、さらに50マイクロリットルのC溶液を各ウェルに加えます。空気中の37°Cで約10分間細胞をインキュベートします。
インキュベーション中に、プロトコルの管理ボタンをクリックしてマイクロプレートリーダープログラムのパラメータの設定を開始します。[新規作成] ボタンをクリックします。[計測方法]セクションで蛍光強度を選択し、[読み取りモード]セクションで[ウェルモード]を選択します。
次に、[OK] ボタンをクリックします。新しいタブが表示されます。[基本パラメータ]メニューで、励起波長を485ナノメートルに設定し、発光を520ナノメートルに設定します。
下から蛍光を読み取るボトム光学を選択します。次に、測定開始時間をゼロ秒、間隔の数を 25、ウェルあたりのフラッシュ数、間隔を 20、間隔を 0.4 秒に設定します。[レイアウト]メニューで、読み取るプレートの領域を描画します。
濃度/体積/シャッキングメニューでは、マイクロプレートリーダーを設定して、1秒間に135マイクロリットルの注入速度で各ウェルに100マイクロリットルのI溶液を注入します。[射出時間] メニューで、射出開始時間を 1 秒に設定します。次に、[測定の開始]ボタンをクリックします。
インキュベーションが完了したら、96ウェルプレートをマイクロプレートリーダーに移し、測定開始ボタンをもう一度クリックして測定を開始します。本研究では、ヨウ素黄色蛍光タンパク質間ギャップ接合間通信アッセイを、LN215-YFPおよびLN215-ヨウ素細胞と共に使用して、細胞内通信変調器の新規ギャップ接合接点を同定する2,320化学物質をスクリーニングする。ホモサレートは、細胞内通信のギャップ接合の50%を阻害することが見られる。
テルビナフィンは完全にそれを阻害しながら..これは、ギャップ接合阻害剤としてテルビナフィンを確認します。このアッセイは、隣接するドナーとアクセプター細胞の間のGJICを測定するので、ドナー細胞とアクセプター細胞は、めっき前に完全に解解剖する必要があります。
そして、混合培養の合流は、細胞間のギャップ接合の形成を最大化するために100%であるべきである。経度データ、用量応答関係、およびギャップ接合変調器の可逆性を評価することは、ヨウ化-YFP-GJICアッセイで得ることができる。また、ヨウ化-YFP特異的なコネキシンGJICアッセイは、機能ギャップ接合部を欠いた細胞に目的のコネキシンの発現を誘導することによって確立することができる。
これにより、特定の種類のコネキシンの化学物質のIC50値を決定することができる。ヨウ化 -YFP-GJIC アッセイは、堅牢で再現性があり、安価であるため、ハイスループットスクリーニングに使用できます。このアッセイは、創薬や毒物学的評価のための化学物質を変調するギャップ接合部を見つけるのに役立ちます。
