La expresión heteróloga de conexinas e inexinas en ovocitos de Xenopus es un enfoque poderoso para analizar las propiedades biofísicas de las uniones de brecha. La principal ventaja de nuestra técnica es utilizar un enfoque de medición de corriente de lado alto que es apropiado para abrazaderas de voltaje de doble sitio. El procedimiento será demostrado por Yuan Shui, un becario postdoctoral de mi laboratorio.
Tan pronto como se defoliculen del 70 al 80% de los ovocitos, decante la solución enzimática inclinando suavemente el tubo. Lave los ovocitos cinco veces llenando el tubo con solución ND96 y luego decantando la solución. Después del lavado final, transfiera los ovocitos a una placa de Petri de 60 milímetros que contenga una solución de ND96.
Use una pipeta Pasteur de vidrio limpio para recoger y transferir ovocitos grandes y de aspecto saludable a una placa de Petri de 60 milímetros que contiene una solución de ND96 suplementada con piruvato de sodio y estreptomicina de penicilina. Prepare una placa de inyección de ovocitos pegando un pequeño trozo de malla de nylon en el fondo de una placa de Petri de 35 milímetros. Llene la placa de inyección de ovocitos aproximadamente hasta la mitad con la solución de ND96 suplementada con piruvato y estreptomicina de penicilina.
Luego, coloque de 25 a 30 ovocitos en filas dentro de la placa de Petri. Llene una micropipeta de inyección con aceite mineral ligero e insértela en el soporte de micropipeta del inyector. Transfiera el ARNc de una de las alícuotas almacenadas a la superficie interior de una cubierta o fondo de placa de Petri mediante pipeteo.
Presione el botón de relleno en el controlador del inyector para aspirar la gota de ARNc en la punta de la micropipeta. Luego, presione el botón de inyección para inyectar el ARNc. Transfiera los ovocitos inyectados a una nueva placa de Petri que contenga una solución de ND96 suplementada con piruvato y estreptomicina de penicilina.
Manténgalos dentro de la cámara ambiental a 15 a 18 grados celsius durante uno a tres días. Reemplace la solución diariamente transfiriendo los ovocitos a una nueva placa de Petri. Use dos pinzas finas para despegar suavemente la membrana transparente de villina que envuelve al ovocito.
Luego, coloque dos ovocitos por pocillo en una cámara de emparejamiento de ovocitos que contenga la solución ND96. Conecte la sonda de voltaje diferencial y los cables de corriente a la celda modelo. Luego, conecte los zócalos rojo y negro a la sonda de voltaje diferencial con el puente incluido y conecte cualquiera de las patas del puente a cualquiera de los pines de la celda del modelo.
Conecte el cable de tierra de la celda modelo al cable desde la toma de circuito de tierra del amplificador. Gire las perillas de desplazamiento de VM y de desplazamiento VE para poner a cero el voltaje de membrana y los medidores de corriente de membrana. Cambie la abrazadera de apagado a rápido o lento y gire el dial de ganancia en el sentido de las agujas del reloj a un nivel que permita que la abrazadera de voltaje adecuada ponga a cero el electrodo de voltaje y los medidores de electrodo de baño del amplificador.
Ejecute un protocolo de adquisición simple que contenga algunos pasos de voltaje para confirmar que el voltaje que se muestra en el medidor de voltaje de membrana cambia de acuerdo con el protocolo de adquisición, y que los rastros de voltaje y corriente se muestran correctamente en Clampex. Coloque una placa de Petri que contenga los ovocitos emparejados en el receptáculo de la placa de Petri de la plataforma de grabación. Seleccione un par de ovocitos y gire la placa de Petri si es necesario, de modo que los dos ovocitos estén en la dirección izquierda y derecha.
Bloquee el escenario en posición por su base magnética. Coloque un electrodo de referencia cerca del borde de la placa de Petri hacia el lado del usuario. Luego, conecte el electrodo de referencia al zócalo negro en solo una de las dos sondas de voltaje diferencial.
Tome un par de micropipetas de vidrio, rompa un poco de la punta con un escribano de diamante y alise el borde de la punta puliendo al fuego. Sostenga la micropipeta por encima de la llama de un quemador de alcohol y doble hasta un ángulo suave a aproximadamente un centímetro de distancia de la punta. Vuelva a llenar la pipeta de vidrio completamente con una solución ND96 y luego insértela en un soporte de microelectrodo prellenado.
Asegúrese de que no haya burbujas de aire presentes en el sistema. Inserte el pin de dos milímetros del soporte de microelectrodo en el zócalo de dos milímetros de un cable de conexión de electrodo de voltaje diferencial. Sujete el zócalo de dos milímetros en una pinza de base magnética y apunte la punta del electrodo de voltaje diferencial hacia uno de los dos ovocitos.
Inserte el pin de un milímetro del cable de conexión del electrodo de voltaje diferencial en el zócalo rojo de la sonda de voltaje diferencial en el mismo lado. Prepare los electrodos de voltaje y corriente de los capilares de vidrio y llénelos con solución de cloruro de potasio. Luego, inserte los electrodos en los soportes de electrodos provistos con los amplificadores.
Baje los electrodos en la solución de baño y gire los diales de compensación VM y VE offset para poner a cero el voltaje de membrana y los medidores de corriente de membrana. Compruebe la resistencia del electrodo presionando la prueba de electrodo VM y la prueba de electrodo VE. Inserte los electrodos de corriente y voltaje en los ovocitos y observe los potenciales negativos de la membrana.
A continuación, en la sección de la abrazadera del amplificador, confirme que la ganancia de CC está en la posición. Gire la perilla de ganancia en el sentido de las agujas del reloj a un nivel que permita una abrazadera de voltaje adecuada y gire el interruptor de la abrazadera de apagado a rápido. Por último, ejecute un protocolo de adquisición.
Aquí se muestra un diagrama del experimento de ovocitos. Los pasos de voltaje de membrana negativo y positivo se aplican al ovocito 1 desde un voltaje de membrana de retención de menos 30 milivoltios, mientras que el ovocito 2 se mantiene a un voltaje de membrana constante de menos 30 milivoltios. El voltaje trans-unión, o Vj, se define como el voltaje de membrana del ovocito 2 menos el voltaje de membrana del ovocito 1.
Las imágenes representativas muestran las trazas de muestra de Lj y la relación de voltaje trans-unión de conductancia de unión normalizada resultante de las uniones de brecha homotípica UNC-9. Aquí se muestran los rastros de muestra de Lj y la relación Gj-Vj normalizada resultante de las uniones de brecha homotípicas UNC-7b. Los resultados muestran que estos dos tipos de Gjs difieren en la tasa de inactivación de Ij dependiente de Vj, la dependencia de Vj y la cantidad de Gj residual.Al intentar el procedimiento, es muy importante asegurarse de que el sistema de electrodos de voltaje diferencial no tenga burbujas de aire y su punta esté dirigida muy cerca del ovocito y los electrodos de voltaje y corriente tengan una resistencia de aproximadamente un microohmio.
Nuestra técnica es fácil de implementar. Puede ser de particular interés para aquellos laboratorios que están recientemente interesados en el uso de ovocitos de Xenopus para estudiar las uniones de brecha.
