Des jonctions d’écart ont été suggérées comme cibles de drogue. L’analyse Iodide-YFP-GJIC est compatible avec le criblage à haut débit pour découvrir les modulateurs de jonction d’écart. Il a été utilisé pour tester les effets d’un grand nombre de composés sur les activités de jonction des écarts dans une période relativement courte.
L’analyse Iodide-YFP-GJIC est simple, robuste, reproductible et peu coûteuse. Cet essai ne nécessite que des cellules acceptatrices et donneuses et deux solutions de sel équilibrées. Aucun reagent supplémentaire comme Lucifer jaune et Calcein AM n’est nécessaire.
En outre, il mesure les activités totales de jonction de l’écart des cellules dans un seul puits, ce qui entraîne une faible variabilité entre les puits. Pour commencer cette procédure, faire croître les cellules LN215 à 80% de confluence dans le DMEM complété tel que décrit dans le protocole de texte. Un jour avant la transduction laver les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS.
Ajouter deux millilitres de 0,25% trypsine EDTA aux cellules et incuber à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, resuspendez les cellules en cinq millilitres de milieu de culture et ajustez la densité cellulaire à 50 000 cellules par millilitre. Ajouter 400 microlitres de médias qui contiennent 20 000 cellules à chaque puits d’une plaque de culture de 24 puits.
Incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, transduire deux puits en remplaçant le milieu de culture par 400 microlitres d’un mélange un-à-un d’un lentivirus et d’un milieu de culture frais complété par du polybrene à une concentration finale de quatre microgrammes par millilitre. Pour les contrôles sans virus remplacer le milieu de culture par milieu de culture frais complété par du polybrene à une concentration finale de quatre microgrammes par millilitre.
Incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 heures. Ensuite, aspirez le milieu contenant des lentivirus, et milieu de culture frais. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 72 heures supplémentaires.
Après cela, laver les cellules dans chaque puits deux fois avec 0,5 millilitres de PBS. Ajouter 300 microlitres de 0,25% trypsine EDTA aux cellules, et incuber à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Resuspendez les cellules en deux millilitres de milieu de culture, puis plaquez-les dans des plaques de culture de six puits avec deux microgrammes par millilitre de puromycine.
Culture des cellules jusqu’à ce que toutes les cellules dans les puits de contrôle sont morts, ce qui prend généralement environ une semaine. Tout d’abord, la culture séparée LN215-YFP et LN215-iodure cellules dans des plaques de 100 millimètres dans le milieu de la culture pour atteindre les populations requises pour l’analyse. Un jour avant le test, laver chaque assiette avec 10 millilitres de PBS.
Traitez chaque assiette avec deux millilitres de 0,25% trypsine EDTA solution, et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Resuspendez les cellules en quatre millilitres de milieu de culture et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugeuse à 1000 g pendant trois minutes pour pelleter les cellules.
Jetez le supernatant et resuspendez chaque granule cellulaire en cinq millilitres de milieu de culture. Pipette de haut en bas environ 20 fois pour briser les touffes de cellules. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.
Et puis diluer les cellules dans le milieu de la culture pour faire la suspension cellulaire aux densités indiquées ici. Ensuite, mélangez sept millilitres de chaque suspension cellulaire ensemble dans un réservoir. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 100 microlitres de ce mélange à chaque puits d’une plaque de culture de 96 puits.
Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Tout d’abord, utilisez un microscope à fluorescence avec grossissement 20X et un filtre GFP pour vérifier les plaques de 96 puits pour s’assurer qu’il n’y a pas de touffes de cellules, et que les cultures sont entièrement confluentes et bien réparties. Au moins 30 minutes avant l’essai allumer un lecteur de microplaque et le mettre à 37 degrés Celsius.
Laver le tube d’un injecteur automatisé avec trois millilitres de 70 % d’éthanol, trois millilitres d’eau distillée et trois millilitres de solution I. Ensuite, réchauffez les solutions C et I à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau. Soit aspirer le milieu de croissance ou inverser la plaque pour la vider.
Appuyez sur n’importe quel milieu résiduel. Ajoutez ensuite la solution C à un réservoir à l’aide d’une pipette multicanal pour ajouter 200 microlitres de solution C à chaque puits de la plaque. Soit aspirer la solution ou inverser la plaque pour la vider, ce qui rend à exploiter n’importe quelle solution résiduelle.
Ajouter 50 microlitres de solution C à chaque puits. Ajoutez ensuite un microlitre d’un stock chimique de 2,5 milli molaires ou DMSO comme véhicule, et ajoutez 50 microlitres de solution C à chaque puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans l’air pendant environ 10 minutes.
Pendant l’incubation, commencez à définir les paramètres du programme de lecteur de microplaques en cliquant sur le bouton Gérer les protocoles. Cliquez sur le nouveau bouton. Sélectionnez l’intensité de fluorescence dans la section Méthode de mesure et mode Puits dans la section Mode lecture.
Ensuite, cliquez sur le bouton OK. Un nouvel onglet apparaîtra. Dans le menu Paramètres de base réglez la longueur d’onde Excitation à 485 nanomètres, et l’émission à 520 nanomètres.
Sélectionnez l’optique Bottom pour lire la fluorescence par le bas. Réglez ensuite l’heure de début de mesure à zéro seconde, le nombre d’intervalles à 25, le nombre de flashs par puits et l’intervalle à 20, et le temps d’intervalle à 0,4 secondes. Dans le menu Layout dessiner une région de l’assiette à lire.
Dans le menu Concentrations/Volumes/Shacking, réglez le lecteur de microplaques pour injecter 100 microlitres de solution I à chaque puits avec une vitesse d’injection de 135 microlitres par seconde. Dans le menu Temps d’injection définir l’heure de début d’injection pour être une seconde. Cliquez ensuite sur le bouton de mesure Démarrer.
Lorsque l’incubation est terminée, transférez les plaques de 96 puits au lecteur de microplaque et recommencez la mesure en cliquant à nouveau sur le bouton de mesure Démarrer. Dans cette étude, l’essai fluorescent iodine-jaune de protéine-écart de jonction-intercellulaire de communication est employé avec des modules intracellulaires de communication de jonction de LN215-YFP et de LN215 pour examiner 2.320 produits chimiques pour identifier de nouveaux modulateurs intracellulaires de communication de jonction d’écart. Homosalate est vu pour inhiber 50% de la communication intracellulaire de jonction d’écart.
Alors que la terbinafine l’inhibe complètement. Ceci confirme la terbinafine comme inhibiteur de jonction d’écart. Cet essai mesure le GJIC entre les cellules voisines du donneur et de l’accepteur, de sorte que les cellules du donneur et de l’accepteur doivent être complètement dissociées avant le placage.
Et la confluence de la culture mixte devrait être à 100% pour maximiser la formation de jonctions d’écart entre les cellules. Les données sur le cours du temps, les relations de réponse à la dose et l’évaluation de la réversibilité des modulateurs de jonction des écarts peuvent être obtenues à l’aide de l’analyse Iodide-YFP-GJIC. En outre, des analyses spécifiques de connexin GJIC d’Iodide-YFP peuvent être établies en induisant l’expression d’une connexine d’intérêt dans les cellules dépourvues des jonctions fonctionnelles d’écart.
Cela permet de déterminer la valeur IC50 d’un produit chimique d’un type spécifique de connexine. L’analyse Iodide-YFP-GJIC peut être utilisée pour le criblage à haut débit, car elle est robuste, reproductible et peu coûteuse. Cet essai aide à trouver la jonction d’écart modulant des produits chimiques pour la découverte de drogue et l’évaluation toxicologique.
