Gap kavşakları uyuşturucu hedefleri olarak öne sürülmüşlerdir. Iodide-YFP-GJIC tsöplisi, boşluk bağlantı modülatörlerini keşfetmek için yüksek iş leme taraması ile uyumludur. Nispeten kısa bir süre içinde boşluk kavşak faaliyetleri üzerinde bileşiklerin çok sayıda etkilerini test etmek için kullanılmıştır.
Iodide-YFP-GJIC analizi basit, sağlam, tekrarlanabilir ve ucuzdur. Bu töz sadece kabul ve donör hücreleri ve iki dengeli tuz çözeltisi gerektirir. Lucifer sarısı ve Calcein gibi ek reaktifler gerekmez.
Ayrıca tek bir kuyudaki hücrelerin toplam boşluk kavşak aktivitelerini ölçer ve bu da iyi-değişkenlik arasında düşük bir sonuç verir. Bu yordamı başlatmak için ln215 hücreleri büyümek 80% metak ile eklenmiş DMEM metin protokolünde belirtildiği gibi. Transdüksiyondan bir gün önce hücreleri 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın.
Hücrelere %0.25 tripsin EDTA'dan iki mililitre ekleyin ve 37 derecede üç dakika kuluçkaya yatırın. 10 mililitrelik serolojik pipet kullanarak, beş mililitre lik kültür ortamındaki hücreleri yeniden askıya almak ta ve hücre yoğunluğunu mililitrede 50.000 hücreye ayarlar. 24 kuyulu bir kültür plakasının her kuyuya 20.000 hücre içeren 400 mikrolitre medya ekleyin.
24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Ertesi gün mililitre başına dört mikrogram lık son konsantrasyonda polibren ile desteklenen bir lentivirüs ve taze kültür ortamının bire bir karışımının 400 mikrolitresi ile kültür ortamını değiştirerek iki kuyu yuvarlayın. Hiçbir virüs kontrolleri için mililitre başına dört mikrogram son konsantrasyonda polibren ile takviye taze kültür ortamı ile kültür ortamı değiştirin.
15 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Sonra lentiviruses içeren orta aspire, ve taze kültür orta. Hücreleri 72 saat ek olarak 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, 0,5 mililitre PBS ile her kuyudaki hücreleri iki kez yıkayın. Hücrelere %0,25 tripsin EDTA'dan 300 mikrolitre ekleyin ve 37 derecede üç dakika kuluçkaya yatırın. İki mililitre kültür ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın ve mililitre püromisin başına iki mikrogram ile altı kuyulu kültür plakalarına koyun.
Kültür kontrol kuyularında tüm hücreler ölü kadar hücreleri, genellikle yaklaşık bir hafta sürer. İlk olarak, ayrı ayrı kültür LN215-YFP ve LN215-iyodür hücreleri 100 milimetrelik plakalar kültür ortamda tsurel için gerekli popülasyonlara ulaşmak için. Bir gün önce, pbs 10 mililitre ile her plaka yıkayın.
Her plakayı %0,25 tripsin EDTA çözeltisi ile iki mililitre ile tedavi edin ve 5 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Dört mililitre kültür ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın ve 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Hücreleri peletlemek için üç dakika için 1,000 g santrifüj.
Supernatant atın ve kültür orta beş mililitre her hücre pelet resuspend. Pipet herhangi bir hücre kümeleri kırmak için yaklaşık 20 kez yukarı ve aşağı. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın.
Ve sonra burada gösterilen yoğunluklarda hücre süspansiyon yapmak için kültür ortamı hücreleri seyreltmek. Daha sonra, her hücre süspansiyonunun yedi mililitresini bir rezervuarda karıştırın. 96 kuyulu bir kültür plakasının her kuyusu için bu karışımın 100 mikrolitresini eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.
24 saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat. İlk olarak, 96 kuyulu plakaları kontrol etmek için 20X büyütmeli floresan mikroskobu ve GFP filtresi kullanın. Bir mikroplaka okuyucuaçmak ve 37 santigrat dereceye ayarlamak önce en az 30 dakika.
Otomatik bir enjektörün tüpünü üç mililitre 70%etanol, üç mililitre distile su ve üç mililitre I-çözeltisi ile yıkayın. Daha sonra, C ve I-çözeltilerini su banyosunda 37 dereceye ısıtın. Ya büyüme ortamını aspire edin ya da boşaltmak için plakayı ters çevirin.
Artık ortama dokunun. Daha sonra plakanın her kuyusu için 200 mikrolitre C-çözeltisi eklemek için çok kanallı pipet kullanarak bir rezervuara C-çözeltisi ekleyin. Ya çözeltiaspire veya plakayı ters çevirerek boşaltmak için, artık çözeltiyi dışarı atamasını sağlar.
Her kuyuya 50 mikrolitre C-çözeltisi ekleyin. Daha sonra bir araç olarak 2,5 milimolar kimyasal stok veya DMSO bir mikrolitre ekleyin ve her kuyuya 50 mikrolitre C-çözeltisi ekleyin. Hücreleri 37 derecede havada yaklaşık 10 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sırasında, Protokolleri Yönet düğmesini tıklatarak mikroplaka okuyucu programındaki parametreleri ayarlamaya başlayın. Yeni düğmesini tıklatın. Ölçüm Yöntemi bölümündeFloresan Yoğunluk ve Okuma Modu bölümünde Kimod'u seçin.
Ardından, Tamam düğmesini tıklatın. Yeni bir sekme görüntülenir. Temel Parametreler menüsünde Uyarma dalga boyu 485 nanometre, Emisyon ise 520 nanometre olarak belirlenmiştir.
Floresan'ı alttan okumak için Alt optik'i seçin. Daha sonra ölçüm başlangıç saatini sıfır saniye, aralık ların sayısı 25, kuyu başına yanıp sönme sayısını ve 20 olmak üzere aralık sayısını ve aralık süresini 0,4 saniye olarak ayarlayın. Düzen menüsünde okunacak plakanın bir bölgesini çizin.
Konsantrasyonlar/Hacimler/Shacking menüsünde mikroplaka okuyucu, saniyede 135 mikrolitre enjeksiyon hızıyla her kuyuya 100 mikrolitre I-çözelti enjekte etmeye ayarlayın. Enjeksiyon Süresi menüsünde enjeksiyon başlangıç saatini bir saniye olarak ayarlayın. Ardından Ölçüm Başlat düğmesini tıklatın.
Kuluçka tamamlandığında, 96 kuyulu plakaları mikroplaka okuyucuya aktarın ve yeniden Başlat ölçüm düğmesini tıklatarak ölçüme başlayın. Bu çalışmada, iyot-sarı floresan protein-gap kavşak-hücrelerarası iletişim testi LN215-YFP ve LN215-iyot hücreleri ile ekran 2, 320 kimyasallar yeni boşluk kavşak hücre içi iletişim modülatörleri tanımlamak için kullanılır. Homosalate'in hücre içi gap kavşağının %50'sini inhibe edilebistir.
Terbinafine tamamen inhibe ederken. Bu bir boşluk kavşak inhibitörü olarak terbinafine doğrular. Bu titreci, komşu donör ve kabul eden hücreler arasındaki GJIC'yi ölçer, bu nedenle donör ve kabul eden hücreler kaplamadan önce tamamen ayrıştırılmalıdır.
Ve karışık kültürün birleşimi hücreler arasındaki boşluk kavşaklarının oluşumunu en üst düzeye çıkarmak için %100 olmalıdır. Zaman ders verileri, doz yanıt ilişkileri ve gap kavşak modülatörlerinin geri döndürülebilirliğini değerlendirmek Iodide-YFP-GJIC tsömu ile elde edilebilir. Ayrıca, Iodide-YFP spesifik connexin GJIC tahlilleri fonksiyonel boşluk kavşaklarından yoksun hücrelere ilgi connexin ifadesini indükleyerek kurulabilir.
Bu connexin belirli bir tür bir kimyasal IC50 değerini belirlemek mümkün kılar. Iodide-YFP-GJIC tsöplisi yüksek iş elde tarama için kullanılabilir, çünkü sağlam, tekrarlanabilir ve ucuzdur. Bu tahliller ilaç keşfi ve toksikolojik değerlendirme için kimyasallar modüle boşluk kavşak bulmak için yardımcı olur.
