Junções de lacunas foram sugeridas como alvos de drogas. O ensaio Iodide-YFP-GJIC é compatível com a triagem de alto rendimento para descobrir moduladores de junção de lacunas. Ele tem sido usado para testar os efeitos de um grande número de compostos em atividades de junção de lacunas em um período relativamente curto.
O ensaio Iodide-YFP-GJIC é simples, robusto, repetível e barato. Este ensaio requer apenas células aceitadoras e doadoras e duas soluções de sal balanceados. Não são necessários reagentes adicionais como lúcifer amarelo e Calcein AM.
Também mede as atividades totais de junção de lacunas das células em um único poço que resulta em baixa variabilidade entre poços. Para iniciar esse procedimento, as células LN215 aumentam para 80% de confluência no DMEM suplementado, conforme descrito no protocolo de texto. Um dia antes da transdução lavar as células duas vezes com 10 mililitros de PBS.
Adicione dois mililitros de 0,25% de trippsina EDTA às células e incubar a 37 graus Celsius por três minutos. Usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros resuspend as células em cinco mililitros de cultura média e ajustar a densidade celular para 50.000 células por mililitro. Adicione 400 microliters de mídia que contém 20.000 células a cada poço de uma placa de cultura de 24 poços.
Incubar a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte transduem dois poços substituindo o meio de cultura por 400 microliters de uma mistura de um para um de um lentivírus e meio de cultura fresca complementado com polibreno em uma concentração final de quatro microgramas por mililitro. Para os controles sem vírus substitua o meio de cultura por meio de cultura fresca complementado com polibrene em uma concentração final de quatro microgramas por mililitro.
Incubar a 37 graus Celsius por 15 horas. Em seguida, aspire o meio contendo lentivírus e meio de cultura fresca. Incubar as células a 37 graus Celsius por mais 72 horas.
Depois disso, lave as células em cada poço duas vezes com 0,5 mililitros de PBS. Adicione 300 microliters de 0,25% de trippsina EDTA às células, e incubar a 37 graus Celsius por três minutos. Resuspend as células em dois mililitros de cultura média, e, em seguida, emplaque-los em placas de cultura de seis poços com dois microgramas por mililitro de puromicina.
Cultume as células até que todas as células dos poços de controle estejam mortas, o que geralmente leva aproximadamente uma semana. Primeiro, cultura separada LN215-YFP e células de iodeto LN215 em placas de 100 milímetros em meio de cultura para alcançar as populações necessárias para o ensaio. Um dia antes do ensaio, lave cada placa com 10 mililitros de PBS.
Trate cada placa com dois mililitros de solução EDTA de 0,25% trypsin e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos. Resuspend as células em quatro mililitros de cultura média e transferi-las para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrífuga a 1.000 g por três minutos para pelotar as células.
Descarte o supernatante e resuspenque cada pelota de célula em cinco mililitros de meio de cultura. Pipeta para cima e para baixo cerca de 20 vezes para quebrar qualquer aglomerado de células. Use um hemótmetro para contar as células.
E então diluir as células em meio de cultura para fazer suspensão celular nas densidades mostradas aqui. Em seguida, misture sete mililitros de cada suspensão celular em um reservatório. Use uma pipeta multicanal para adicionar 100 microliters desta mistura a cada poço de uma placa de cultura de 96 poços.
Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Primeiro, use um microscópio de fluorescência com ampliação de 20X e um filtro GFP para verificar as placas de 96 poços para ter certeza de que não há aglomerados de células, e que as culturas são totalmente confluentes e bem distribuídas. Pelo menos 30 minutos antes do ensaio ligar um leitor de microplacão e defini-lo para 37 graus Celsius.
Lave a tubulação de um injetor automatizado com três mililitros de 70% de etanol, três mililitros de água destilada e três mililitros de solução I. Em seguida, aqueça as soluções C e I a 37 graus Celsius em um banho de água. Ou aspirar o meio de crescimento ou inverter a placa para esvaziá-la.
Toque em qualquer meio residual. Em seguida, adicione a solução C a um reservatório usando uma pipeta multicanal para adicionar 200 microliters de solução C a cada poço da placa. Ou aspirar a solução ou inverter a placa para esvaziá-la, fazendo com que ela toque em qualquer solução residual.
Adicione 50 microliters de solução C a cada poço. Em seguida, adicione um microliter de um estoque químico de 2,5 mililitros ou DMSO como veículo, e adicione outros 50 microliters de solução C a cada poço. Incubar as células a 37 graus Celsius no ar por aproximadamente 10 minutos.
Durante a incubação, comece a definir os parâmetros do programa de leitor de microplaca clicando no botão Gerenciar protocolos. Clique no botão Novo. Selecione a intensidade de fluorescência na seção Método de Medição e o Modo Bem na seção Modo de Leitura.
Em seguida, clique no botão OK. Uma nova guia aparecerá. No menu Parâmetros Básicos, defina o comprimento de onda de Excitação para 485 nanômetros e a emissão para 520 nanômetros.
Selecione a óptica inferior para ler fluorescência a partir da parte inferior. Em seguida, defina o tempo de início da medição como zero segundos, o número de intervalos a ser de 25, o número de flashes por poço e intervalo para 20, e o tempo de intervalo para 0,4 segundos. No menu Layout desenhe uma região da placa para ser lida.
No menu Concentrações/Volumes/Shacking, ajuste o leitor de microplacos para injetar 100 microliters de solução I para cada poço com uma velocidade de injeção de 135 microliters por segundo. No menu Tempo de injeção, defina a hora de início da injeção para um segundo. Em seguida, clique no botão de medição Iniciar.
Quando a incubação estiver completa, transfira as placas de 96 poços para o leitor de microplaca e inicie a medição clicando novamente no botão de medição Iniciar novamente. Neste estudo, o ensaio de comunicação de junção proteína-intercelular fluorescente iodo-amarelo é usado com células LN215-YFP e LN215-iodo para tela 2.320 produtos químicos para identificar novos moduladores de comunicação intracelular de junção de lacunas. O homosalate é visto para inibir 50% da comunicação intracelular de junção de lacunas.
Enquanto terbinafina inibe completamente. Isso confirma a terbinafina como um inibidor de junção de lacunas. Este ensaio mede o GJIC entre as células doadoras vizinhas e aceitadoras, de modo que as células doadoras e aceitadoras devem ser completamente dissociadas antes do revestimento.
E a confluência da cultura mista deve ser 100% para maximizar a formação de junções de lacunas entre as células. Os dados do curso de tempo, as relações de resposta à dose e a avaliação da reversibilidade dos moduladores de junção de lacunas podem ser obtidos com o ensaio Iodide-YFP-GJIC. Além disso, ensaios connexin específicos Iodide-YFP podem ser estabelecidos induzindo a expressão de uma connexin de interesse nas células desprovidas de junções de lacunas funcionais.
Isso permite determinar o valor IC50 de um produto químico de um tipo específico de connexina. O ensaio Iodide-YFP-GJIC pode ser usado para triagem de alto rendimento, por ser robusto, repetível e barato. Este ensaio ajuda a encontrar produtos químicos moduladores de junção de lacunas para descoberta de drogas e avaliação toxicológica.
