Nuestro protocolo permite a los investigadores aislar las moléculas de señalización bioactiva utilizadas por los reptiles en la comunicación química. Así como la separación y purificación de estos compuestos para pruebas adicionales, o incluso la identificación. Usando este método, los investigadores pueden obtener una fuente de señales químicas y luego extraerlas para su cuantificación o uso de bioensayo de forma aislada.
Demostrando el procedimiento hoy estará Holly Rucker, una estudiante de tesis de honor de mi laboratorio. Comience colocando piezas cuadradas de cinco centímetros en un recipiente de vidrio sellable con una tapa compatible con hexano y añadiendo suficiente hexano al recipiente para sumergir completamente las piezas de piel del cobertizo antes de sellar el recipiente. Al día siguiente, utilice fórceps metálicos limpios para retirar las piezas del lodo, agitando las piezas a medida que se capturan para retener cualquier hexano restante dentro del recipiente.
Para determinar la masa lipídica extraída, transfiera el extracto a un matraz inferior redondo prepesado y encienda la fuente de vacío al evaporador rotativo asegurándose de que la presión de vacío es suficiente para sujetar el matraz al cuello del condensador. Abra el respiradero al final del condensador, deslice el matraz sobre el cuello del condensador y cierre la ventilación para sellar el sistema. Después de asegurarse de que el matraz no se puede desconectar del condensador cuando se suelta el matraz.
Baje el matraz hasta que sólo el 10% inferior del matraz toque el agua en el baño, e inicie la rotación a velocidad media. Si el vacío, la velocidad, el flujo del condensador y la temperatura del baño son óptimos, el vapor de disolvente que sale del matraz se condensará en la bobina y goteará en el matraz de recuperación. Evaporar la muestra bajo el vacío hasta que un cordón de líquido con un diámetro inferior a un centímetro sea visible en la parte inferior del matraz.
A continuación, apague la rotación y el vacío, y levante el matraz fuera del baño. Sujete el cuello del matraz mientras se suelta el sello de vacío y gire el cuello para apartar el matraz del condensador. La perla de líquido en el extracto se solidificará a medida que el hexano se evapora.
Después de que el cordón se haya secado a temperatura ambiente durante unos cinco minutos, los lípidos formarán una cera translúcida de color blanco a amarillo en el matraz. Pesar el matraz para obtener la masa final y solubilizar los lípidos en el volumen registrado de hexano para producir un miligramo o más de lípidos por mililitro de hexano. Para preparar una columna de cromatografía, utilice una varilla de madera, más larga que la columna para colocar un cuadrado de cuatro por cuatro centímetros de fibra de vidrio plegada en la parte inferior de una columna de cromatografía de vidrio.
Fije la columna en una campana de humo a un soporte de anillo estándar y abra el llave. A continuación, vierta la arena lavada y seca en la columna hasta que aproximadamente tres centímetros de arena descanse por encima de la fibra de vidrio. A continuación, coloque el papel oscuro debajo de la columna y tóquelo suavemente.
Ahora, coloque un vaso de precipitados de 500 mililitros debajo de la columna y moje lentamente la arena con aproximadamente 25 mililitros de hexano, cerrando el llavero cuando hay aproximadamente 0,5 centímetros de hexano por encima de la arena. Para activar la illumina neutra, pipeta desionizó el agua de un volumen igual al 6% de la masa de illumina en gotas a lo largo de la illumina. Y cubra el matraz de la illumina activada, arremolinando vigorosamente la solución para dispersar uniformemente la carga.
Cuando no queden grumos visibles de illumina, agregue hexano hasta que la illumina esté completamente cubierta con unos 0,5 centímetros de hexano. Gire el matraz para formar una suspensión, y coloque un nuevo vaso de vidrio de 500 mililitros debajo de la columna. Abra el llave, luego gire la illumina de nuevo, antes de verter constantemente la illumina en un embudo ventilado sostenido en el depósito de la columna, teniendo cuidado de que la illumina se asiente uniformemente dentro de la columna y que no se formen grandes burbujas o grietas.
La columna se forma cuando la parte superior de la illumina es estable y aproximadamente cuatro centímetros por debajo del cuello de la columna en la base del depósito. A continuación, utilice una pipeta para enjuagar el interior del depósito con hexano para la illumina residual, y agregue suavemente una segunda capa de arena en la parte superior de la illumina a aproximadamente un centímetro por debajo del depósito. Para el fraccionamiento del extracto de lípidos, utilice una pipeta de vidrio larga para transferir la muestra de lípidos a la columna y pipetee lentamente el extracto para evitar perturbar la capa de arena.
Enjuague el extracto con cinco mililitros de hexano y transfiera el lavado a la columna. Cuando se haya agregado todo el extracto, abra el llave y permita que la muestra se cargue en la columna. Una vez agregada la muestra, la columna debe permanecer saturada de disolvente.
Si la columna se seca, la muestra se perderá. Coloque un matraz inferior redondo prepesado y etiquetado debajo de la columna para recoger la primera fracción. Y utilice un embudo de vidrio ventilado para verter hexano al 100% a un lado del depósito para evitar perturbar la capa de arena.
Luego, abra el llave para comenzar la elución, cerrando el tapón cuando aproximadamente tres mililitros de hexano permanecen por encima de la arena en la parte superior de la columna. A medida que los animales más grandes producen naturalmente más lípidos de la piel debido a su mayor superficie total de la piel, es importante estandarizar la masa lipídica extraída a la longitud de ventilación del hocico del animal. Una vez estandarizada a la masa total de la piel del depósito, se elimina por completo la relación lineal de la masa lipídica de la piel extraída con la masa de la piel del verto.
Después del fraccionamiento, se puede utilizar el mismo enfoque de estandarización con las masas de las fracciones individuales. Por ejemplo, aquí cada fracción no está contribuyendo por igual a la masa lipídica total extraída, ya que los lípidos neutros son el conjunto dominante de compuestos por proporción de masa, en comparación con cada conjunto de lípidos más polares. Si la identificación de compuestos es el objetivo final, utilice cristalería limpia y debe evitar los plásticos para evitar la contaminación de las muestras.
Para la identificación de compuestos, la cromatografía líquida o de gases, junto con la espectrometría de masas se pueden perseguir después de recoger las muestras. Alternativamente, se pueden realizar bioensayos para dilucidar la actividad biológica de la muestra.
