우리의 프로토콜은 연구원이 화학 통신에서 파충류에 의해 사용되는 생리 활성 신호 분자를 격리 할 수 있습니다. 뿐만 아니라 추가 테스트를 위한 이러한 화합물의 분리 및 정제, 또는 식별. 이 방법을 사용하여, 연구원은 화학 신호의 근원을 얻고 그(것)들을 격리에 있는 그들의 정량화 또는 bioassay 사용을 위해 그(것)들을 추출할 수 있습니다.
오늘 절차를 시연하는 것은 홀리 루커, 내 실험실에서 명예 의학 학생이 될 것입니다. 먼저 5센티미터 제곱 조각을 육산 과 호환 뚜껑이 있는 밀봉 가능한 유리 용기에 넣고 용기에 충분한 헥산을 추가하여 용기를 밀봉하기 전에 창고 피부 조각을 완전히 잠수합니다. 다음 날, 깨끗한 금속 집게를 사용하여 창고 조각을 제거하고, 용기 내에 남은 헥산을 유지하기 위해 포획될 때 조각을 흔들어 보입니다.
추출된 지질 질량 전달을 결정하기 위해 추출물을 미리 계량하고 둥근 바닥 플라스크로 전환하여 진공 압력이 응축기의 목에 플라스크를 고정하기에 충분한지 확인하기 위해 진공 공급원을 회전 증발기로 켭니다. 응축기 끝에 통풍구를 열고 플라스크를 응축기의 목에 밀어 놓고 통풍구를 닫아 시스템을 밀봉합니다. 플라스크가 해제될 때 플라스크가 응축기에서 분리할 수 없도록 한 후.
플라스크의 하부 10%만이 욕조의 물에 닿을 때까지 플라스크를 낮추고 중간 속도로 회전을 시작합니다. 진공, 속도, 응축기 흐름 및 목욕 온도가 최적이라면 플라스크를 떠나는 용매 증기가 코일에 응축되어 회복 플라스크로 떨어집니다. 직경이 1센티미터 미만인 액체의 비드가 플라스크 의 바닥에 보일 때까지 진공 아래의 샘플을 증발시한다.
그런 다음 회전과 진공을 끄고 플라스크를 목욕에서 들어 올립니다. 진공 씰이 방출될 때 플라스크 목을 잡고 응축기에서 플라스크를 옆으로 비틀습니다. 추출물의 액체 비드는 헥산이 증발함에 따라 고화됩니다.
비드가 실온에서 약 5분 동안 건조되면, 지질은 플라스크에 반투명 흰색에서 노란색 왁스를 형성합니다. 플라스크의 무게를 측정하여 최종 질량을 얻고 헥산의 기록된 부피에서 지질을 용해하여 헥산의 1 밀리리터당 1밀리그램 이상의 지질을 산출합니다. 크로마토그래피 컬럼을 준비하려면 기둥보다 긴 나무 다웰 로드를 사용하여 유리 크로마토그래피 기둥 바닥에 접힌 유리 섬유의 4-4센티미터 사각형을 배치합니다.
연기 후드의 컬럼을 표준 링 스탠드에 고정하고 스톱콕을 엽니다. 다음으로, 약 3센티미터의 모래가 유리섬유 위에 놓일 때까지 씻고 말린 모래를 기둥에 붓습니다. 그런 다음 어두운 용지를 열 아래에 놓고 부드럽게 누릅니다.
이제 기둥 아래에 500 밀리리터 비커를 놓고 육산의 약 25 밀리리터로 모래를 천천히 적시고 모래 위에 약 0.5 센티미터의 헥산이있을 때 스톱콕을 닫습니다. 중성 일루미나를 활성화하기 위해, 일루미나 전체의 낙하에 있는 일루미나 질량의 6%와 동일한 부피의 파이펫 을 산화하였다. 그리고 활성화 된 일루미나의 플라스크를 덮고 용액을 적극적으로 소용돌이어 전하를 균등하게 분산시합니다.
일루미나의 눈에 보이는 덩어리가 남아 있지 않은 경우, 일루미나가 육산의 약 0.5센티미터로 완전히 덮일 때까지 육산을 추가합니다. 플라스크를 소용돌이모양으로 돌리면 슬러리를 형성하고 기둥 아래에 새로운 500 밀리리터 유리 비커를 놓습니다. 스톱콕을 열고 일루미나를 다시 소용돌이치게 한 다음, 일루미나를 기둥의 저수지에 보관한 환기 깔때기에 꾸준히 붓고, 일루미나가 기둥 안에 고르게 정착하고 큰 거품이나 균열이 형성되지 않도록 주의하십시오.
기둥은 일루미나의 상단이 안정되고 저수지 의 기지에서 기둥의 목 아래 약 4 센티미터 때 형성됩니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 저수지 내부를 육산조명으로 헹구고, 저수지 아래 약 1센티미터에 일루미나 위에 두 번째 모래층을 부드럽게 넣습니다. 지질 추출물의 분획을 위해 긴 유리 파이펫을 사용하여 지질 샘플을 컬럼으로 옮기고 추출물을 천천히 피펫하여 모래 층을 방해하지 않도록 합니다.
헥산 5밀리리터로 추출물을 헹고 세척을 기둥으로 옮겨버세요. 모든 추출이 추가되었을 때 스톱콕을 열고 샘플이 열에 로드되도록 합니다. 샘플이 추가되면 컬럼은 용매로 채도 상태를 유지해야 합니다.
열이 마르면 샘플이 손실됩니다. 첫 번째 분획을 수집하기 위해 열 아래에 미리 계량되고 레이블이 표시된 둥근 바닥 플라스크를 배치합니다. 그리고 모래 층을 방해하지 않도록 저장기 의 측면에 100 % 헥산을 부어 환기 유리 깔때기를 사용합니다.
그런 다음 스톱콕을 열어 용출을 시작하고, 헥산의 약 3 밀리리터가 기둥 의 상단에있는 모래 위에 남아있을 때 스톱콕을 닫습니다. 큰 동물은 피부 표면적이 커서 자연적으로 더 많은 피부 지질을 생성하므로 추출된 지질 덩어리를 동물의 주미 통풍구 길이로 표준화하는 것이 중요합니다. 일단 총 창고 피부 질량으로 표준화되면 추출된 피부 지질 질량과 추출된 피부 지질 덩어리의 선형 관계가 완전히 제거됩니다.
다음 분획, 동일한 표준화 접근 방식은 개별 분획의 질량과 함께 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 여기서 각 분획은 총 추출지질 질량에 동등하게 기여하지 않으며, 중성 지질은 질량 비율에 의한 화합물의 지배적인 집합이기 때문에, 더 많은 극지 지질의 각 세트에 비해. 화합물의 식별이 궁극적인 목표인 경우 깨끗한 유리 제품을 사용하며 플라스틱을 피하여 시료의 오염을 방지해야 합니다.
화합물 식별을 위해, 액체 또는 가스 크로마토그래피를 위해, 대량 분광과 결합하여 시료를 수집한 후에 추구될 수 있다. 대안적으로, 바이오아세이션은 시료의 생체 활성을 해명하기 위해 수행될 수 있다.
