Il nostro protocollo consente ai ricercatori di isolare le molecole di segnalazione bioattive utilizzate dai rettili nella comunicazione chimica. Così come la separazione e la purificazione di questi composti per ulteriori test, o anche l'identificazione. Utilizzando questo metodo, i ricercatori possono ottenere una fonte di segnali chimici e quindi estrarli per la loro quantificazione o l'uso del saggio biologico in isolamento.
A dimostrare la procedura oggi sarà Holly Rucker, una studentessa di tesi d'onore del mio laboratorio. Inizia posizionando pezzi quadrati di cinque centimetri in un contenitore di vetro sigillabile con un coperchio compatibile con l'esano e aggiungendo abbastanza esano al contenitore per immergere completamente i pezzi della pelle del capannone prima di sigillare il contenitore. Il giorno successivo, utilizzare forcep metallici puliti per rimuovere i pezzi del capannone, scuotendo i pezzi mentre vengono catturati per trattenere l'esano rimanente all'interno del contenitore.
Per determinare la massa lipidica estratta trasferire l'estratto in un pallone inferiore rotondo pre pesato e accendere la fonte del vuoto all'evaporatore rotante assicurandosi che la pressione sottovuoto sia sufficiente per tenere il pallone al collo del condensatore. Aprire lo sfiato all'estremità del condensatore, far scorrere il pallone sul collo del condensatore e chiudere lo sfiato per sigillare il sistema. Dopo aver assicurato che il pallone non possa disconnettersi dal condensatore quando il pallone viene rilasciato.
Abbassare il pallone fino a quando solo il 10% inferiore del pallone tocca l'acqua nella vasca da bagno e iniziare la rotazione a media velocità. Se il vuoto, la velocità, il flusso del condensatore e la temperatura del bagno sono ottimali, il vapore solvente che esce dal pallone si condensa sulla bobina e gocciola nel pallone di recupero. Evaporare il campione sotto il vuoto fino a quando una perla di liquido con un diametro inferiore a un centimetro è visibile nella parte inferiore del pallone.
Quindi spegnere la rotazione e il vuoto e sollevare il pallone dal bagno. Tenere il collo del pallone quando viene rilasciata la guarnizione sottovuoto e ruotare il collo sul lato del pallone dal condensatore. La perla di liquido nell'estratto si solidificherà man mano che l'esano evapora.
Dopo che il tallone si è asciugato a temperatura ambiente per circa cinque minuti, i lipidi formeranno una cera traslucida da bianca a gialla nel pallone. Pesare il pallone per ottenere la massa finale e solubilizzare i lipidi nel volume registrato di esano per produrre un milligrammo o più di lipidi per un millilitro di esano. Per preparare una colonna cromatografica, utilizzare un assorbente di legno, più lungo della colonna per posizionare un quadrato di fibra di vetro piegato di quattro per quattro centimetri nella parte inferiore di una colonna di cromatografia in vetro.
Fissare la colonna in una cappa aspirante a un supporto standard e aprire il fermapista. Quindi, versare la sabbia lavata e asciugata nella colonna fino a quando circa tre centimetri di sabbia poggiano sopra la fibra di vetro. Quindi, posizionare la carta scura sotto la colonna e toccarla delicatamente.
Ora, metti un becher da 500 millilitri sotto la colonna e bagna lentamente la sabbia con circa 25 millilitri di esano, chiudendo il fermacock quando c'è circa 0,5 centimetri di esano sopra la sabbia. Per attivare l'illuminamento neutro, pipetta ha deionizzato acqua di un volume pari al 6% della massa illuminante in gocce in tutto l'illuminamento. E coprire il pallone di illuminamento attivato, ruotando vigorosamente la soluzione per disperdere uniformemente la carica.
Quando non rimangono grumi visibili di illuminare, aggiungere l'esano fino a quando l'illuminamento non è completamente coperto con circa 0,5 centimetri di esano. Ruotare il pallone per formare un liquame e posizionare un nuovo bicchiere di vetro da 500 millilitri sotto la colonna. Aprire il tapvio, quindi ruotare di nuovo l'illuminamento, prima di versare costantemente l'illuminamento in un imbuto ventilato tenuto nel serbatoio della colonna, facendo attenzione che l'illumina si stabilizza uniformemente all'interno della colonna e che non si formino grandi bolle o crepe.
La colonna si forma quando la parte superiore dell'illumina è stabile e circa quattro centimetri sotto il collo della colonna alla base del serbatoio. Quindi, utilizzare una pipetta per risciacquare l'interno del serbatoio con esano per l'illuminamento residuo e aggiungere delicatamente un secondo strato di sabbia sopra l'illuminamento a circa un centimetro sotto il serbatoio. Per il frazionamento dell'estratto lipidico, utilizzare una lunga pipetta di vetro per trasferire il campione lipidico alla colonna e pipettare lentamente l'estratto per evitare di disturbare lo strato di sabbia.
Risciacquare l'estratto vile con cinque millilitri di esano e trasferire il lavaggio sulla colonna. Una volta aggiunta tutta l'estrazione, aprire il fermacock e consentire al campione di caricarsi nella colonna. Una volta aggiunto il campione, la colonna deve rimanere satura di solvente.
Se la colonna si asciuga, l'esempio andrà perso. Posizionare un pallone inferiore rotondo pre pesato ed etichettato sotto la colonna per raccogliere la prima frazione. E utilizzare un imbuto di vetro ventilato per versare il 100% di esano sul lato del serbatoio per evitare di disturbare lo strato di sabbia.
Quindi, apri il fermacock per iniziare l'eluizione, chiudendo il fermacock quando circa tre millilitri di esano rimangono sopra la sabbia nella parte superiore della colonna. Poiché gli animali più grandi producono naturalmente più lipidi cutanei a causa della loro maggiore superficie totale della pelle, è importante standardizzare la massa lipidica estratta in base alla lunghezza dello sfiato del muso dell'animale. Una volta standardizzata alla massa totale della pelle capannone, la relazione lineare della massa lipidica della pelle estratta con la massa della pelle del capannone estratta viene completamente rimossa.
Dopo il frazionamento, lo stesso approccio di standardizzazione può essere utilizzato con le masse delle singole frazioni. Ad esempio, qui ogni frazione non contribuisce allo stesso modo alla massa lipidica totale estratta, poiché i lipidi neutri sono l'insieme dominante di composti per proporzione di massa, rispetto a ogni insieme di lipidi più polari. Se l'identificazione dei composti è l'obiettivo finale, utilizzare vetrerie pulite ed evitare la plastica per prevenire la contaminazione dei campioni.
Per l'identificazione composta, la cromatografia liquida o gassometrica, abbinata alla spettrometria di massa, può essere perseguita dopo la raccolta dei campioni. In alternativa, i test bio possono essere condotti per chiarire l'attività biologica del campione.
