Nosso protocolo permite que os pesquisadores isolem moléculas de sinalização bioativa usadas por répteis na comunicação química. Bem como a separação e purificação desses compostos para testes adicionais, ou mesmo identificação. Usando este método, os pesquisadores podem obter uma fonte de sinais químicos e, em seguida, extraí-los para sua quantificação ou uso de bioensaio isoladamente.
Demonstrando o procedimento de hoje será Holly Rucker, uma estudante de tese de honra do meu laboratório. Comece colocando peças quadradas de cinco centímetros em um recipiente de vidro vedado com uma tampa compatível com hexano e adicionando hexano suficiente ao recipiente para submergir totalmente as peças da pele do galpão antes de selar o recipiente. No dia seguinte, use fórceps metálicos limpos para remover os pedaços do galpão, sacudindo as peças à medida que são capturadas para reter qualquer hexano restante dentro do recipiente.
Para determinar a massa lipídica extraída transfira o extrato para um frasco de fundo pré-pesado e redondo e ligue a fonte de vácuo para o evaporador rotativo certificando-se de que a pressão do vácuo é suficiente para segurar o frasco no pescoço do condensador. Abra a ventilação na extremidade do condensador, deslize o frasco para o pescoço do condensador e feche a ventilação para selar o sistema. Depois de certificar-se de que o frasco não pode se desconectar do condensador quando o frasco for liberado.
Abaixe o frasco até que apenas os 10% inferiores do frasco toquem a água no banho e inicie a rotação em velocidade média. Se o vácuo, a velocidade, o fluxo do condensador e a temperatura do banho forem ótimos, o vapor solvente que deixar o frasco se condensará na bobina e pingará no frasco de recuperação. Evaporar a amostra sob o vácuo até que uma caixa de líquido com menos de um centímetro de diâmetro seja visível na parte inferior do frasco.
Em seguida, desligue a rotação e o vácuo, e levante o frasco para fora do banho. Segure o pescoço do frasco enquanto a vedação de vácuo é liberada, e torça o pescoço para o lado do frasco do condensador. A conta de líquido no extrato se solidificará à medida que o hexano evaporar.
Depois que a conta secar à temperatura ambiente por cerca de cinco minutos, os lipídios formarão uma cera translúcida de branco a amarelo no frasco. Pese o frasco para obter a massa final e solubilize os lipídios no volume registrado de hexano para produzir um miligrama ou mais de lipídio por um mililitro de hexano. Para preparar uma coluna de cromatografia, use uma haste de dowel de madeira, mais longa que a coluna para posicionar um quadrado de fibra de vidro dobrado de quatro por quatro centímetros na parte inferior de uma coluna de cromatografia de vidro.
Fixar a coluna em um capô de fumaça em um suporte de anel padrão e abrir a torneira. Em seguida, despeje areia lavada e seca na coluna até que aproximadamente três centímetros de areia fique acima da fibra de vidro. Em seguida, coloque papel escuro sob a coluna e toque suavemente.
Agora, coloque um béquer de 500 mililitros sob a coluna e molhe lentamente a areia com aproximadamente 25 mililitros de hexano, fechando a torneira quando há aproximadamente 0,5 centímetros de hexano acima da areia. Para ativar a ilumina neutra, a água deionizada pipeta de um volume igual a 6% da massa de ilumina em gotas ao longo da ilumina. E cubra o frasco de ilumina ativada, girando vigorosamente a solução para dispersar uniformemente a carga.
Quando não houver aglomerados visíveis de ilumina, adicione hexano até que a luminária esteja completamente coberta com cerca de 0,5 centímetros de hexano. Gire o frasco para formar um chorume, e coloque um novo copo de vidro de 500 mililitros sob a coluna. Abra a torneira, depois gire a luminária novamente, antes de despejar a luminária em um funil ventilado mantido no reservatório da coluna, tomando cuidado para que a luminária se instale uniformemente dentro da coluna e que não se forme grandes bolhas ou rachaduras.
A coluna é formada quando a parte superior da ilumina está estável e aproximadamente quatro centímetros abaixo do pescoço da coluna na base do reservatório. Em seguida, use uma pipeta para enxaguar o interior do reservatório com hexano para iluminal residual, e adicione suavemente uma segunda camada de areia em cima da iluminal a aproximadamente um centímetro abaixo do reservatório. Para fracionamento do extrato lipíduo, use uma pipeta de vidro longa para transferir a amostra lipídica para a coluna e lentamente pipeta o extrato para evitar perturbar a camada de areia.
Enxágüe o extrato vil com cinco mililitros de hexano e transfira a lavagem para a coluna. Quando todo o extrato foi adicionado, abra a torneira e deixe a amostra carregar na coluna. Uma vez adicionada a amostra, a coluna deve permanecer saturada com solvente.
Se a coluna se apagar, a amostra será perdida. Coloque um frasco traseiro redondo pré-pesado e rotulado sob a coluna para coletar a primeira fração. E use um funil de vidro ventilado para derramar 100% de hexano na lateral do reservatório para evitar perturbar a camada de areia.
Em seguida, abra a torneira para iniciar a elução, fechando a torneira quando aproximadamente três mililitros de hexano permanecem acima da areia no topo da coluna. Como animais maiores produzem naturalmente mais lipídios de pele devido à sua maior área total da superfície da pele, é importante padronizar a massa lipídica extraída ao comprimento da ventilação do focinho do animal. Uma vez padronizada à massa total da pele, a relação linear da massa lipídica da pele extraída com a massa da pele extraída é completamente removida.
Após o fracionamento, a mesma abordagem de padronização pode ser usada com as massas das frações individuais. Por exemplo, aqui cada fração não está contribuindo igualmente para a massa lipídica total extraída, pois os lipídios neutros são o conjunto dominante de compostos por proporção de massa, em comparação com cada conjunto de lipídios mais polares. Se a identificação dos compostos for o objetivo final, use vidros limpos e você deve evitar plásticos para evitar a contaminação das amostras.
Para identificação composta, cromatografia líquida ou gasosa, juntamente com espectrometria de massa pode ser perseguida após a coleta das amostras. Alternativamente, bioensaudis podem ser realizados para elucidar a atividade biográfica da amostra.
