当社のプロトコルにより、研究者は化学通信で爬虫類が使用する生理活性シグナル伝達分子を分離することができます。追加のテスト、あるいは同定のためにこれらの化合物の分離および精製と同様。この方法を使用すると、研究者は化学信号の供給源を取得し、それらを抽出して定量化またはバイオアッセイを単独で使用することができます。
今日の手順を実証するのは、私の研究室の優等研究生であるホリー・ラッカーです。5センチメートルの正方形の部分をヘキサン互換の蓋付きの密封可能なガラス容器に入れ、容器を密封する前に小屋の皮片を完全に水没させるのに十分なヘキサンを容器に加えることによって始めます。翌日、きれいな金属鉗子を使用して小屋の破片を取り除き、容器内の残りのヘキサンを保持するために捕獲された破片を振ります。
抽出した脂質を測定するために抽出物を予め計量し、底フラスコを丸くし、真空源をロータリーエバポレーターに回し、真空圧が凝縮器の首にフラスコを保持するのに十分であることを確認する。コンデンサーの端にある通気孔を開き、フラスコをコンデンサーの首にスライドさせ、ベントを閉じてシステムを密封します。フラスコが解放されたときにフラスコが凝縮器から切り離すことができないことを確認した後。
フラスコの底部10%だけが浴中の水に触れるまでフラスコを下げ、中速で回転を開始します。真空、速度、凝縮器流れ、および浴温度が最適である場合、フラスコを離れる溶媒蒸気はコイルに凝縮し、回収フラスコに滴り落ちます。直径1センチ未満の液体ビーズがフラスコの底に見えるまで、真空下でサンプルを蒸発させます。
その後、回転と真空をオフにし、お風呂からフラスコを上げます。真空シールが解放されるとフラスコの首を持ち、コンデンサーからフラスコを横に向けます。抽出液中のビーズは、ヘキサンが蒸発するにつれて固化する。
ビーズが室温で5分程度乾燥した後、脂質はフラスコに半透明の白色から黄色のワックスを形成する。フラスコを秤量して最終的な質量を得て、ヘキサンの記録された体積の脂質を可溶化し、ヘキサンの1ミリリットル当たり1ミリグラム以上の脂質を得る。クロマトグラフィーカラムを作成するには、木製のダボロッドを使用し、柱よりも長く、ガラスクロマトグラフィーカラムの下部に折りたたまれたグラスグラスの4〜4センチメートルの正方形を配置します。
ヒュームフードのカラムを標準のリングスタンドに固定し、ストップコックを開きます。次に、約3センチメートルの砂がグラスファイバーの上に置かれるまで、洗浄して乾燥した砂をカラムに注ぎます。次に、暗い紙を列の下に置き、軽くタップします。
さて、柱の下に500ミリリットルのビーカーを置き、約25ミリリットルのヘキサンでゆっくりと砂を濡らし、砂の上に約0.5センチメートルのヘキサンがある場合にストップコックを閉じます。中性のイルミナを活性化するために、ピペットは、イルミナ全体の滴で6%のイルミナ質量に等しい体積の水を脱イオン化した。そして活性化されたイルミナのフラスコを覆い、電荷を均等に分散させる溶液を激しく渦巻く。
目に見えるイルミナの塊が残っていない場合は、イルミナが約0.5センチメートルのヘキサンで完全に覆われるまでヘキサンを加えます。フラスコを旋回してスラリーを形成し、柱の下に新しい500ミリリットルのガラスビーカーを置きます。ストップコックを開き、再びイルミナを渦巻き、柱の貯水池に保持されている通気漏斗にイルミナを着実に注ぐ前に、イルミナが柱の中に均等に落ち着き、大きな泡や亀裂が形成されないように注意してください。
このカラムは、イルミナの上部が安定し、貯水池の底部にある柱の首より約4センチメートル下に形成されます。次に、ピペットを使用して残留照度のためにヘキサンで貯水池の内部をすすい、ミルミナの上に2番目の砂の層を穏やかに加えて、貯水池の約1センチメートル下に加えます。脂質抽出物の分画については、長いガラスピペットを使用して脂質サンプルをカラムに移し、ゆっくりとピペット抽出液をピペットして砂の層を乱さないようにします。
抽出物を5ミリリットルのヘキサンですすいで、洗浄物をカラムに移します。すべての抽出物が追加されたら、ストップコックを開き、サンプルを列にロードします。サンプルを加えたら、カラムは溶媒で飽和状態を保たなければなりません。
カラムが枯渇すると、サンプルは失われます。最初の分数を収集するために、事前に計量され、ラベル付けされた丸い底フラスコを柱の下に置きます。そして、ベントガラス漏斗を使用して、砂の層を乱さないように貯水池の側面に100%ヘキサンを注ぎます。
次に、ストップコックを開けて溶出を開始し、約3ミリリットルのヘキサンが列の上部の砂の上に残っているときにストップコックを閉じます。大きな動物は、その大きな皮膚表面積のために自然により多くの皮膚脂質を産生するので、抽出された脂質質量を動物のスナッストベント長に標準化することが重要である。一旦全流皮膚質量に標準化されると、抽出された皮膚の質量と抽出された皮膚の質量との抽出された皮膚脂質塊の直線的な関係が完全に除去される。
分別後、同じ標準化アプローチを個々の分数の質量と共に使用できます。例えば、ここで各画分は、抽出された脂質質量の総量に等しく寄与しておらず、中性脂質が質量割合で化合物の支配的な集合となるように、より多くの極性脂質の各セットと比較する。化合物の同定が最終的な目標である場合は、クリーンなガラス製品を使用し、サンプルの汚染を防ぐためにプラスチックを避ける必要があります。
化合物同定のために、液体またはガスクロマトグラフィー、質量分析と結合して、サンプルが収集された後に追求することができる。あるいは、バイオアッセイを行って、サンプルの生物活性を解明することができる。
