Здесь мы демонстрируем анализ высокого содержания рецепторов, который совместим с первичной подготовкой нейронной культуры. Этот метод отдельно маркирует поверхность межпоистерными рецепторными пулами фиксированных нейронов. Включение представления данных как соотношения нормализованной поверхности или интернализированной плотности рецепторов к общей плотности этого рецептора.
Анализ высокого содержания и незаконного оборота рецепторов обеспечивает эффектное средство измерения массовых изменений профилей торговли рецепторами в нейронной сети в ответ на различные факторы. Потребляя гораздо меньше времени и материалов, чем альтернативные методы. Нарушения и торговля предцепторами были связаны с многочисленными неврологическими расстройствами и считаются привлекательными целями для медикаментозной терапии.
Например, исследования показали, что одним из самых ранних признаков болезни Альцгеймера является синаптическая потеря и уменьшение синаптических и предцепторных бассейнов. Этот метод требует много различных шагов различной сложности. Особенно потому, что обработка 96 хорошо пластины и манипулирования скважин может оказаться трудным для кого-то без опыта.
А поскольку результаты эксперимента очень чувствительны к неправильной обработке, полезно просматривать различные выполняемые шаги. Инструктор Для начала, кормить нейроны в 96 хорошо пластины, удалив 100 микролитров уже существующих средств массовой информации из каждой хорошо. И заменить его 100 микролитров средств массовой информации предварительно нагревается до 37 градусов по Цельсию.
Каждые три-четыре дня. В день в пробирке 14, использовать мульти-трубы, чтобы удалить 100 микролитров средств массовой информации из каждой хорошо и объединить средства массовой информации. Добавьте два микролитров решения TTX Stock в один миллилитр кондиционированных средств массовой информации для создания четырех микромоляного раствора TTX.
Лечить нейроны в каждом хорошо с 100 микролитров из четырех микромоляных TTX раствора. Если не хватает объединяются средства массовой информации условия добавить некоторые из ранее хранящихся средств массовой информации. Инкубировать в инкубаторе 5%CO2 при 37 градусах по Цельсию в течение четырех часов.
После этого удалите существующий TTX, содержащий мультимедиа и добавьте 200 микролитров предварительно разогретых нейрональных средств массовой информации, и инкубировать микро пластину при комнатной температуре в течение пятнадцати минут. Сначала удалите нейрональные средства массовой информации из микро-пластины. Добавьте пятьдесят микролитров антиглуА1 или антиглуа2 антитела к соответствующим скважинам микро пластины.
Добавьте пятьдесят микролитров нейрональных средств массовой информации к вторичным антителам только контроль скважин. Инкубировать при комнатной температуре в течение двадцати минут, чтобы обеспечить связывание антител. После этого удалите существующие средства массовой информации из скважин.
Вымойте микро пластину три раза с 100 микролитров нейрональных средств комнатной температуры на колодец, чтобы удалить любые неограниченные антитела. Затем добавьте 100 микролитров 100 микромоляров раствора DHPG для каждой хорошо. Инкубировать в инкубаторе двуокиси углерода 5%при 37 градусах по Цельсию в течение десяти минут.
Затем удалите раствор DHPG и добавьте 100 микролитров нейрональных средств массовой информации к каждой хорошо. Повторите этот процесс во второй раз. Затем инкубировать в 5%carbon двуокиси инкубатора при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут.
В день эксперимента подготовьем раствор 4%параформальдегида и 4%сахарозы NPBS. Удалите средства массовой информации из каждой хорошо и заменить его 100 микролитров параформальдегида и раствора сахарозы. Повторите этот процесс для каждой точки времени добавления.
Инкубировать микро пластины при 4 градусах по Цельсию в течение двадцати минут. Затем удалите фиксатор и добавьте 100 микролитров DPBS к каждой колодец. Удалите DPBS и добавьте 150 микролитров блокирующего буфера к каждой колодец.
Инкубировать при комнатной температуре в течение девяносто минут. Удалите блокирующий буфер и добавьте 50 микролитров вторичного раствора антител к каждой колодец. Инкубировать при комнатной температуре в течение шестидесяти минут, сохраняя при этом пластины защищены от света.
Удалите раствор антител и добавьте 100 микролитров TBS к каждой колодец. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторите этот процесс, удалив средства массовой информации из скважин, добавляющих TBS, и инкубации при комнатной температуре еще четыре раза.
После этого снимите TBS с микро пластины. Добавьте 100 микролитров раствора 4%параформальдегида и 4% сахарозы в PBS к каждой хорошо. Инкубировать при комнатной температуре в течение пятнадцати минут.
Удалите раствор параформальдегида и добавьте 100 микролитров TBS в каждую колодец и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторите этот шаг еще два раза. Сначала подготовите раствор TBS, содержащий 2%saponin и вихрем раствор кратко полностью растворить порошок сапонина.
Используя 2-метровый фильтр, фильтруйте раствор, чтобы удалить любые частицы, которые могут вызвать аутофторесценцию. Добавьте 150 микролитров этого 2%сапонина раствора к каждой хорошо, и инкубировать при комнатной температуре в течение пятнадцати минут. Затем удалите раствор сапонина и добавьте в каждую колодец 150 микролитров блокирующего буфера.
Инкубировать при комнатной температуре в течение девяносто минут. После этого удалите блокирующий буфер и добавьте пятьдесят микролитров вторичного раствора антител к каждой колодец. Инкубировать при комнатной температуре в течение шестидесяти минут.
Затем добавьте 100 микролитров TBS к каждой колодец и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторите этот процесс, добавляя TBS и инкубации при комнатной температуре четыре дополнительных раза. Использование инфракрасной лазерной системы визуализации изображения 96 хорошо микро пластины в соответствии с инструкциями производителей.
Установите разрешение сканирования до 84 микрометров. Качество сканирования до среднего и фокус компенсируется в зависимости от базовой высоты 96 хорошо микро пластины используется. Нажмите на кнопку меню Image Studio, экспортировать изображение для цифровых медиа и экспортировать изображения с разрешением 300 dpi в формате TIFF.
Откройте изображение в ImageJ Фиджи. Разделите цветные каналы, нажав на меню изображения, а затем цвет, разделить каналы. Затем откройте менеджера рентабельности инвестиций из анализа, инструментов.
Проверьте поле для меток в менеджере рентабельности инвестиций, чтобы классифицировать круги с номерами. В 6 80, или красный канал, выберите область интереса, выбрав круг инструмент и рисунок круг, который точно соответствует первому хорошо. Затем нажмите Ctrl плюс T, перетаскивая круг к следующему колодец.
Повторите этот процесс до тех пор, пока все скважины не будут обведены. Из меры roi manager нажмите кнопку. Выберите значения, которые появляются, и скопировать их на лист распространения.
Следующий клик по зеленому каналу и транспонировать выбранные ROIs на изображение. Из меры roi manager нажмите кнопку. Выберите значения, которые появляются, и скопировать их на лист распространения.
После этого вычислить изменения выражения поверхностных рецепторов, как указано в текстовом протоколе. В этой процедуре сохранение дуги в регулировании торговли рецепторами амфы изучается с использованием высококонтентного оборота рецепторов ампы и анализа. Нейроны обрабатываются блокатором натрия-ионных каналов TTX, который подавляет потенциал действия и снижает уровень дуги.
Следуют DHPG, который вызывает дуги перевода и убиквитинации. Как поверхностные, так и интернализируемые пулы gluA1 и gluA2, содержащие субъединиты рецепторов апа, измерялись через пять-пятнадцать минут после вымывания DHPG. ArcKR нейроны показывают увеличение глюА1 эндозитоз при лечении DHPG, по сравнению с в то время как тип нейронов.
Этот эффект не видел, когда нейроны лечатся только TTX. Поверхностное выражение подразделения gluA2 значительно увеличивается в короткие сроки по сравнению с нейронами типа wile. Указание потенциальной замены подразделения.
Убедитесь, что клетки неликвидных фиксированных параформальдегида должны быть подготовлены свежие в день эксперимента. Клетки должны быть повторно зафиксированы после маркировки для поверхностных рецепторов. Другие методы, такие как конфокальная микроскопия, смогут обеспечить одноклеточное разрешение для дальнейшей характеристики связанных измененных в нейронной структуре и локализации рецепторов.
Нарушение временной динамики дуги изменяет оборот рецепторов ампы в ответ на MgluR опосредованное LTD. Будущие направления будут измерять оборот рецепторов ампы в ответ на другие раздражители. Этот анализ, возможно, адаптируется к другим типам клеток, лечения и рецепторов, при условии, что процедура тщательно скорректированы и надлежащим образом проверены.
Необходимо позаботиться о том, чтобы плотность клеток, время лечения, шаги фиксации, шаги по протеабилизации и выбор реагентов были оптимизированы вашей системой интересов. Для успешного и эффективного завершения анализа важно подготовить решение DHPG и 4%paraformaldehyde, 4% раствор сахарозы в день эксперимента. Контроль хорошо лечить с vakeel или TTX необходимы для обеспечения того, чтобы эффекты наблюдается являются специфическими для лечения.
Важно также включить скважины, обработанные только вторичными антителами для контроля фоновой флуоресценции, вырабатываемой неспецифическим связыванием.
