Aqui demonstramos um ensaio de tráfico de receptores de alto conteúdo compatível com a preparação da cultura neuronal primária. Este método rotula separadamente a superfície de uma piscina de receptores interdegadores de neurônios fixos. Permitindo a apresentação de dados como uma razão de densidade de superfície normalizada ou receptor internalizada à densidade geral desse receptor.
O alto teor de conteúdo e o ensaio de tráfico de receptores fornecem um meio efetuado para medir mudanças em massa nos perfis de tráfico de receptores dentro de uma rede neural em resposta a vários fatores. Consumindo muito menos tempo e materiais do que métodos alternativos. Interrupções e no tráfico de preceptores têm sido ligados a múltiplos distúrbios neurológicos, e são considerados alvos atraentes para a terapia medicamentosa.
Por exemplos, estudos mostraram que um dos primeiros sinais da Doença de Alzheimer é a perda sináptica e a diminuição das piscinas sinápticas e preceptoras. Esta técnica requer muitas etapas diferentes de dificuldade variada. Especialmente porque manusear a placa 96 e manipular os poços pode ser difícil para alguém sem experiência.
E como os resultados do experimento são altamente sensíveis ao manuseio inadequado, é útil visualizar as várias etapas que estão sendo realizadas. Instrutor Para começar, alimente os neurônios na placa do poço 96 removendo 100 microliters da mídia pré-existente de cada poço. E substituindo-o por 100 microliters de mídia pré-aquecida a 37 graus Celsius.
A cada três ou quatro dias. Um dia in vitro 14, use um multi-pipet para remover 100 microliters de mídia de cada poço e juntar a mídia. Adicione dois microliters da solução TTX Stock a um mililitro da mídia condicionada agrupada para criar uma solução de quatro micromolares de TTX.
Trate os neurônios em cada poço com 100 microlitres de quatro soluçãos TTX micromolar. Se não houver mídia de condição agrupada suficiente, adicione alguns dos meios de comunicação armazenados anteriormente. Incubar em uma incubadora de 5%CO2 a 37 graus Celsius por quatro horas.
Depois disso, remova o TTX existente contendo mídia e adicione 200 microliters de mídia neuronal pré-aquecida, e incubar a micro placa em temperatura ambiente por quinze minutos. Primeiro remova a mídia neuronal da micro placa. Adicione cinquenta microliters da solução anti gluA1 ou anticorpos anti gluA2 aos poços correspondentes da micro placa.
Adicione 50 microliters de mídia neuronal ao anticorpo secundário apenas controlam poços. Incubar em temperatura ambiente por vinte minutos para permitir a ligação de anticorpos. Depois disso, remova a mídia existente dos poços.
Lave a micro placa três vezes com 100 microliters de mídia neuronal de temperatura ambiente por poço para remover quaisquer anticorpos desvinculados. Em seguida, adicione 100 microliters 100 micromolar de solução de estoque DHPG para cada poço. Incubar em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por dez minutos.
Em seguida, remova a solução DHPG e adicione 100 microliters de mídia neuronal a cada poço. Repita este processo uma segunda vez. Em seguida, incubar na incubadora de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por cinco minutos.
No dia do experimento prepare uma solução de 4% de paraformaldeído e 4% de SNA de sacarose. Remova a mídia de cada poço e substitua-a por 100 microliters da solução paraformaldeída e sacarose. Repita este processo para cada ponto de tempo de adição.
Incubar a micro placa a 4 graus Celsius por vinte minutos. Em seguida, remova o fixador e adicione 100 microliters de DPBS a cada poço. Remova o DPBS e adicione 150 microliters de tampão de bloqueio a cada poço.
Incubar em temperatura ambiente por noventa minutos. Remova o tampão de bloqueio e adicione 50 microliters da solução de anticorpos secundários a cada poço. Incubar em temperatura ambiente por sessenta minutos, mantendo a placa protegida da luz.
Remova a solução de anticorpos e adicione 100 microliters de TBS a cada poço. Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Repita este processo, removendo a mídia dos poços adicionando TBS e incubando à temperatura ambiente quatro vezes adicionais.
Depois disso, remova a TBS da micro placa. Adicione 100 microliters de uma solução de 4% de paraformaldeído e 4% de sacarose em PBS para cada poço. Incubar em temperatura ambiente por quinze minutos.
Remova a solução de paraformaldeído e adicione 100 microliters de TBS em cada poço e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Repita esta etapa duas vezes adicionais. Primeiro prepare uma solução de TBS contendo 2% de saponina e vórtice a solução brevemente para dissolver totalmente o pó de saponina.
Usando um filtro de 2 micrômetros, filtrar a solução para remover quaisquer partículas que possam causar autofluorescência. Adicione 150 microliters desta solução de saponina de 2% a cada poço, e incubar à temperatura ambiente por quinze minutos. Em seguida, remova a solução de saponina e adicione 150 microliters de tampão de bloqueio a cada poço.
Incubar em temperatura ambiente por noventa minutos. Depois disso, remova o tampão de bloqueio e adicione cinquenta microliters da solução de anticorpos secundários a cada poço. Incubar em temperatura ambiente por sessenta minutos.
Em seguida, adicione 100 microliters de TBS a cada poço e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Repita este processo adicionando TBS e incubando à temperatura ambiente quatro vezes adicionais. Usando uma imagem a laser infravermelha imagem do sistema de imagem a laser a placa 96 bem de acordo com as instruções do fabricante.
Defina a resolução da varredura para 84 micrômetros. A qualidade da varredura para médio e o foco compensam de acordo com a altura base da micro placa de 96 poços utilizada. Clique no botão do menu Image Studio, exporte imagem para mídia digital e exporte as imagens com uma resolução de 300 dpi no formato TIFF.
Abra a imagem em ImageJ Fiji. Divida os canais de cores clicando no menu de imagem e, em seguida, colorir, dividir canais. Em seguida, abra o gerente do ROI a partir de análise, ferramentas.
Verifique na caixa as etiquetas do gerenciador de ROI, a fim de classificar os círculos com números. No canal 6 80, ou vermelho, selecione a região de interesse selecionando a ferramenta de círculo e desenhando um círculo que se encaixa com precisão no primeiro poço. Em seguida, pressione Ctrl mais T, arrastando o círculo para o próximo poço.
Repita este processo até que todos os poços sejam circulados. Da medida de clique do gerenciador de ROI. Selecione os valores que aparecem e copie-os em uma planilha.
Clique em seguida no canal verde e transponha os ROIs selecionados para a imagem. Da medida de clique do gerenciador de ROI. Selecione os valores que aparecem e copie-os em uma planilha.
Depois disso, calcule as alterações da expressão do receptor de superfície, conforme descrito no protocolo de texto. Neste procedimento, a persistência do arco na regulação do tráfico de receptores ampa é examinada utilizando-se o tráfico e ensaio de receptores ampa de alto teor. Os neurônios são tratados com o bloqueador de canais de íons de sódio TTX que inibe potenciais de ação e reduz os níveis de arco.
Seguido por DHPG que induz a tradução do arco e a ubiquização. Ambas as piscinas de superfície e internalização de gluA1 e gluA2 contendo subunidades receptoras de apa foram medidas em cinco e quinze minutos após a lavagem do DHPG. Os neurônios ArcKR mostram aumento da endositose gluA1 quando tratados com DHPG, em comparação com os neurônios do tipo.
Este efeito não é visto quando os neurônios são tratados apenas com TTX. A expressão superficial da subunidade gluA2 é aumentada significativamente em pontos de tempo curtos em comparação com neurônios do tipo wile. Indicando uma possível substituição de subunidade.
Certifique-se de que as células são ilíquidas paraformaldeídas devem ser preparadas frescos no dia do experimento. As células devem ser refixas após a rotulagem dos receptores de superfície. Outros métodos, como a microscopia confocal, serão capazes de fornecer resolução celular única para caracterizar ainda mais mudanças relacionadas na estrutura neuronal e localização do receptor.
Interromper a dinâmica temporal do arco altera o tráfico de receptores ampa em resposta ao MgluR mediado LTD. As direções futuras serão medir o tráfico de receptores ampa em resposta a outros estímulos. Este ensaio talvez adaptável a outros tipos de células, tratamentos e receptores, desde que o procedimento seja cuidadosamente ajustado e validado adequadamente.
Deve-se tomar cuidado para garantir que as densidades celulares, os tempos de tratamento, as etapas de fixação, as etapas de permeabilização e as seleções de reagentes sejam otimizadas para o seu sistema de interesse. Para uma conclusão bem-sucedida e eficiente do ensaio é importante preparar a solução DHPG e a solução de 4%paraformaldeído, 4% de sacarose no dia do experimento. O controle bem tratado com vakeel ou TTX é necessário para garantir que os efeitos observados sejam específicos para o tratamento.
Também é fundamental incluir poços tratados apenas com anticorpos secundários para controlar a fluorescência de fundo produzida por ligações não específicas.
