Nuestro enfoque combinado ayuda a responder cómo los parámetros de neuroplasticidad ultraestructural cambian después de las intervenciones tempranas del desarrollo al naciente sistema nervioso en el útero. La principal ventaja de nuestro método es la adquisición de imágenes de alta resolución de macro-meso-micro-y nanoestructuras en el sistema de coordenadas predefinido dentro de un atlas de tejido. La implicación de nuestro método es su potencial terapéutico traslacional para enfermedades neurodegenerativas congénitas.
Por ejemplo, tratamiento y rescate en etapas embrionarias utilizando esta técnica de transducción del útero. Nuestro método se puede aplicar a cualquier otro modelo. Por ejemplo, las especies de ratón se pueden cambiar, así como el área de interés.
Los investigadores que prueban nuestro método por primera vez necesitan un entrenamiento quirúrgico profundo, así como el conocimiento de cómo preparar el tejido para la toma de imágenes microscópicas electrónicas. Comience cargando una punta capilar personalizada que contenga cuatro veces 10 a las 11 partículas virales del recubrimiento de virus asociado al adeno tipo 1 para el objetivo deseado, y etiquetado con tinte Fast Green en un tubo aspirador. Añadir 15 microlitros de las partículas de virus asociadas a adeno etiquetadas en el capilar.
A continuación, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del otro en un ratón embarazada anestesizado día embrionario 14.5 y desinfecte la piel. Utilice fórceps de iris serrados curvos y tijeras rectas de carburo de tungsteno para hacer una incisión de la piel a lo largo de la línea mediana. Usando pinzas dumont rectas para agarrar la pared peritoneal, continúe a lo largo de la linea alba con tijeras Vannas rectas y coloque un pedazo de película de parafina fenestrada sobre la abertura abdominal y use un dispositivo similar a una cuchara para exponer los cuernos uterinos sin dañar los embriones dentro de los cuernos.
Después de aplicar unas gotas de PBS de 37 grados celsius en los cuernos uterinos, inspeccione los embriones en busca de daño o malformaciones dentro del saco uterino. Gire los embriones cuidadosamente dentro de sus sacos hasta que se logre la posición deseada para cada inyección. Cuando los embriones estén en su lugar, inyecte de uno a dos microlitros de la solución de partículas de virus etiquetados con Fast Green en cada embrión.
Después de inyectar todos los embriones, coloque los cuernos uterinos de nuevo en la cavidad abdominal, y agregue unas gotas de PBS de 37 grados Celsius en el abdomen. Luego usa suturas de tamaño poliamida 6-0 para cerrar la pared peritoneal y las suturas de tamaño poliamida 3-0 y los fórceps hemostáticos Mosquito de Halsted para cerrar la piel. Para incrustar tejidos aislados de interés para la fotografía tele-macro, coloque la muestra de tejido en un marco especial con el ángulo de sección reproducible y documente las coordenadas.
Llene el marco con 30 grados-Celsius 3%agarosa hasta que el tejido esté cubierto, y cubra el marco con una tapa de plástico hasta que la agarosa se haya endurecido. Mientras la agarosa se está endureciendo, utilice el dispositivo gráfico tele-macro para crear imágenes del tejido incrustado y sus coordenadas dentro del marco. Cuando la agarosa se haya solidificado, transfiera el tejido incrustado en la agarosa al marco con huecos de corte correspondientes a las coordenadas del primer marco.
Utilice un dispositivo con una cuchilla de afeitar delgada y vibrante para cortar el tejido incrustado en secciones de un espesor experimental adecuado. A continuación, imagine cada sección de tejido en PBS y recopile las imágenes en una carpeta. Para preparar las muestras de tejido para la microscopía electrónica de transmisión, en un gabinete de bioseguridad, lave las secciones tisulares con dos lavados de 30 minutos en PBS, seguido de una incubación de dos horas en una solución de tetróxido de osmio acuosa al 2%a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, lave las secciones osmicadas dos veces más en PBS durante 30 minutos por lavado y deshidrate las secciones en inmersiones secuenciales de etanol de 10 a 15 minutos como se indica. Después de la inmersión de 70%etanol, coloque cada muestra en un plato negro sobre un fondo negro opaco e imagine las muestras en 70%etanol bajo luz LED RGB aplicada a las muestras de los lados izquierdo y derecho en ángulos de 45 grados. Cree un atlas de las imágenes de la sección con coordenadas recopilando imágenes de las muestras en serie en una carpeta.
Tratar los especímenes con dos incubaciones de 30 minutos al 100% de etanol, seguidas de dos incubaciones de óxido de 30 minutos al 100%, ambas a temperatura ambiente. Mientras las muestras están incubando, mezcle la resina recién preparada con óxido de propileno en una a una y una a dos proporciones, y agregue un acelerador del 3% a ambas soluciones. Después de la segunda incubación de óxido de propileno, transfiera las muestras a la solución media de incrustación de óxido de propileno de uno a dos durante dos horas a temperatura ambiente, seguida de una incubación de dos horas en la solución media de incrustación de óxido de propileno de uno a uno a temperatura ambiente.
Al final de la segunda incubación, transfiera los tejidos a platos planos de polipropileno y cure los tejidos incrustados con resina fresca que contenga un acelerador del 3% durante 12 a 24 horas a 65 a 85 grados centígrados. A continuación, enfríe el tejido a temperatura ambiente y retire las muestras incrustadas en resina de los platos de polipropileno. Para asignar un área de interés, seleccione una imagen que contenga el área de interés del atlas de imagen preparado anteriormente.
Dibuje los bordes del área de interés sobre la imagen seccionada, superponga ópticamente estos bordes sobre la muestra incrustada bajo el microscopio, y utilice una aguja de calibre de una pulgada de 26 para rayar estos bordes de la región sobre la muestra de resina. Luego, calienta los especímenes a 95 grados Celsius para suavizar la resina. A continuación, saque las muestras de resina tibia del horno y utilice una cuchilla de afeitar para extirpar las áreas de interés.
Pegue los especímenes en barras de sujeción de vidrio acrílico del calibre adecuado y recorte las muestras montadas para una sección semi y ultrafina. Utilice un ultramicrotoma para adquirir secciones semidelgadas de 0,7 micrómetros y ultradelgadas de 70 nanómetros, recogiendo las secciones semifinas en los soportes de vidrio y las secciones ultradelgadas en las rejillas de níquel. Mancha las secciones semifinas con 1%Toluidina azul en PBS durante cuatro minutos, seguido de varios lavados en agua desionizada, antes de examinar las secciones por microscopía de luz.
Las secciones ultradelgadas pueden evaluarse directamente mediante microscopía electrónica de transmisión a 180 kilovoltas sin más modificaciones. Después de la sección, las rebanadas de tejido son fotografiadas por la fotografía tele-macro como se acaba de demostrar. Después de la osmicación y la inmersión en etanol, las secciones se vuelven a ver mediante una telesmografía de luz de interferencia, revelando un patrón de color específico para cada superficie de tejido.
Después de la deshidratación adicional y la incrustación de resina, las áreas de interés se seleccionan y procesan posteriormente para la microscopía electrónica de transmisión. En el hipocampo y el cerebelo, se sabe que las sinapsis de fibra musgosas presentan características ultraestructurales únicas en comparación con otras sinapsis, incluyendo grandes boutones presinápticos. En sus perfiles de sección transversal, los boutons contienen un gran número de vesículas y mitocondrias, y muy a menudo encierran varias espinas dendríticas.
En la médula espinal, el funiculus dorsal contiene muchas fibras axonales que son mielinadas por oligodendroglia. En las secciones transversales, el funiculus dorsal se puede encontrar entre ambos cuernos posteriores de la médula espinal. En las imágenes de microscopía electrónica de transmisión, los axones mielinados seccionados aparecen redondos, y las vainas de mielina que rodean los axones están organizadas en las lamelas.
El atlas preparado y las imágenes de microscopía electrónica de transmisión micrográfica de los parámetros ultraestructurales no sólo son útiles para la comparación de la neuroplasticidad morfológica de diferentes secciones bajo diversas condiciones de tratamiento, sino también para las comparaciones entre parámetros dentro de la misma área. Recuerde planificar y preparar a fondo antes de comenzar la transducción en el útero, y asegúrese de tener respaldo de materiales e instrumentos en caso de complicaciones. Siguiendo nuestro método, se pueden agregar otras técnicas como el etiquetado de inmunooro antes de la microscopía electrónica para el rastreo ultraestructural de una molécula definida de interés.
Comenzando con una visión holística de todo el organismo y haciendo zoom hacia la topografía molecular, somos capaces de estudiar y manipular la relación entre la función tisular y la morfología. El tetróxido de osmio es peligroso. Asegúrese de trabajar siempre debajo de la capucha, y de usar gafas protectoras y guantes de mano cuando trabaje con este reactivo.
