Il nostro approccio combinato aiuta a rispondere a come cambiano i parametri di neuroplasticità ultrastrutturale dopo i primi interventi di sviluppo al nascente sistema nervoso in utero. Il principale vantaggio del nostro metodo è l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione di macro-meso-micro-e nanostrutture nel sistema di coordinate predefinito all'interno di un atlante tissutale. L'implicazione del nostro metodo è il suo potenziale terapeutico trascizionale per le malattie neurodegenerative congenite.
Ad esempio, il trattamento e il salvataggio a stadi embrionali usando questo nella tecnica di trasduzione utero. Il nostro metodo può essere applicato a qualsiasi altro modello. Ad esempio, le specie di topi possono essere modificate, così come l'area di interesse.
I ricercatori che provano il nostro metodo per la prima volta hanno bisogno di un profondo allenamento chirurgico, così come la conoscenza di come preparare il tessuto per l'imaging microscopico elettronico. Inizia caricando una punta capillare personalizzata contenente quattro volte 10 alle 11 particelle virali del rivestimento virus di tipo 1 adeno-associato per il bersaglio desiderato ed etichettata con colorante Fast Green su un tubo aspiratore. Aggiungere 15 microlitri delle particelle virali etichettate adeno-associate nel capillare.
Successivamente, confermare la mancanza di risposta al dito del piedi in un topo incinta anestetizzato giorno embrionale 14.5 e disinfettare la pelle. Utilizzare forcette dell'iride seghettate curve e forbici dritte in carburo di tungsteno per fare un'incisione cutanea lungo la linea mediana. Utilizzando pinzette Dumont dritte per afferrare la parete peritoneale, continuare lungo la linea alba con forbici Vannas dritte e posizionare un pezzo di pellicola di paraffina fenestrata sopra l'apertura addominale e utilizzare un dispositivo simile a un cucchiaio per esporre le corna uterine senza danneggiare gli embrioni all'interno delle corna.
Dopo aver applicato alcune gocce di PBS a 37 gradi Celsius sulle corna uterine, ispezionare gli embrioni alla ricerca di danni o malformazioni all'interno del sacco uterino. Ruotare accuratamente gli embrioni all'interno delle sacche fino a raggiungere la posizione desiderata per ogni iniezione. Quando gli embrioni sono in posizione, iniettare uno o due microlitri della soluzione di particelle virali etichettate Fast Green in ogni embrione.
Dopo che tutti gli embrioni sono stati iniettati, riposizionare le corna uterine nella cavità addominale e aggiungere alcune gocce di PBS a 37 gradi Celsius nell'addome. Quindi utilizzare suture di dimensioni poliammide 6-0 per chiudere la parete peritoneale e suture di dimensioni poliammide 3-0 e le forcep emostatiche Mosquito di Halsted per chiudere la pelle. Per incorporare tessuti isolati di interesse per la fotografia tele-macro, posizionare il campione di tessuto in una cornice speciale con l'angolo di sessatura riproducibile e documentare le coordinate.
Riempire il telaio con 30 gradi Celsius 3%agarosio fino a quando il tessuto non è coperto e coprire il telaio con un coperchio di plastica fino a quando l'agarosio non si è indurito. Mentre l'agarosio si sta indurendo, usa il dispositivo grafico tele-macro per immagini il tessuto incorporato e le sue coordinate all'interno del fotogramma. Quando l'agarosio si è solidificato, trasferire il tessuto incorporato nell'agarosio nel telaio con spazi di taglio corrispondenti alle coordinate del primo telaio.
Utilizzare un dispositivo con una lama di rasoio sottile e vibrante per tagliare il tessuto incorporato in sezioni di uno spessore sperimentale appropriato. Quindi immagini ogni sezione di tessuto in PBS e raccogli le immagini in una cartella. Per preparare i campioni di tessuto per la microscopia elettronica a trasmissione, in un armadio di biosicurezza, lavare le sezioni tissutali con due lavaggi di 30 minuti in PBS, seguiti da un'incubazione di due ore in soluzione di tetrossido di osmio acquoso al 2% a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni osmicate altre due volte in PBS per 30 minuti per lavaggio e disidratare le sezioni in immersioni sequenziali di etanolo da 10 a 15 minuti come indicato. Dopo l'immersione al 70% di etanolo, posizionare ogni campione in un piatto nero su uno sfondo nero opaco e immagini i campioni in etanolo al 70% sotto la luce RGB LED applicata ai campioni dai lati sinistro e destro con angoli di 45 gradi. Creare un atlante delle immagini della sezione con le coordinate raccogliendo le immagini degli esempi in serie in una cartella.
Trattare i campioni con due incubazioni di etanolo al 100% di 30 minuti, seguite da due incubazioni di ossido di propilene al 100% di 30 minuti, entrambe a temperatura ambiente. Durante l'incubazione dei campioni, mescolare la resina preparata al momento con ossido di propilene a rapporti uno-a-uno e uno-a-due e aggiungere l'acceleratore del 3% a entrambe le soluzioni. Dopo la seconda incubazione di ossido di propilene, trasferire i campioni nella soluzione media di incorporamento di ossido di propilene di resina uno-a-due per due ore a temperatura ambiente, seguita da un'incubazione di due ore nella soluzione media di incorporamento di ossido di propilene di resina uno-a-uno a temperatura ambiente.
Alla fine della seconda incubazione, trasferire i tessuti in piatti in polipropilene e curare i tessuti incorporati con resina fresca contenente il 3% di acceleratore per 12-24 ore a 65-85 gradi Celsius. Quindi raffreddare il tessuto a temperatura ambiente e rimuovere i campioni incorporati nella resina dalle stoviglie in polipropilene. Per mappare un'area di interesse, selezionare un'immagine contenente l'area di interesse dall'atlante delle immagini preparato in precedenza.
Traccia i bordi dell'area di interesse sull'immagine sesata, sovrappone otticamente questi bordi al campione incorporato al microscopio e usa un ago calibro 26 da un pollice per graffiare questi bordi della regione sul campione di resina. Quindi, riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per ammorbidire la resina. Successivamente, esegna i campioni di resina calda dal forno e usa una lama di rasoio per asportare le aree di interesse.
Incollare i campioni su barre di tenuta in vetro acrilico del calibro appropriato e tagliare i campioni montati per sezioni semi-e ultrasottili. Usa un ultramicrotomo per acquisire sezioni semisottili da 0,7 micrometri e ultrasottili da 70 nanometri, raccogliendo le sezioni semisottili sui supporti di vetro e le sezioni ultrasottili sulle griglie di nichel. Macchiare le sezioni semisottili con 1%Toluidina blu in PBS per quattro minuti, seguite da diversi lavaggi in acqua deionizzata, prima di esaminare le sezioni con microscopia leggera.
Le sezioni ultrasottili possono quindi essere valutate direttamente mediante microscopia elettronica a trasmissione a 180 kilovolt senza ulteriori modifiche. Dopo il sezionamento, le fette di tessuto vengono fotografate dalla fotografia tele-macro come appena dimostrato. Dopo l'osmicazione e l'immersione in etanolo, le sezioni vengono nuovamente immaginite dalla tele-macrografia della luce di interferenza, rivelando un motivo specificamente colorato per ogni superficie tissutale.
Dopo un'ulteriore disidratazione e incorporamento della resina, le aree di interesse vengono selezionate e ulteriormente lavorate per la microscopia elettronica a trasmissione. Nell'ippocampo e nel cervelletto, le sinapsi delle fibre muschiose mostrano caratteristiche ultrastrutturali uniche rispetto ad altre sinapsi, tra cui grandi bouton presnaptici. Nei loro profili di sezione trasversale, i bouton contengono un gran numero di vescicole e mitocondri, e molto spesso racchiudono diverse spine dendritiche.
Nel midollo spinale, il funicolo dorsale contiene molte fibre assonali mielinate da oligodendroglia. Sulle sezioni trasversali, il funicolo dorsale può essere trovato tra entrambe le corna posteriori del midollo spinale. Nelle immagini della microscopia elettronica a trasmissione, gli assoni mielini catenati a sezione trasversale appaiono rotondi, e le suone mieline che circondano gli assoni sono organizzate nelle lamelle.
L'atlante preparato e le immagini di microscopia elettronica a trasmissione micrografica dei parametri ultrastrutturali sono utili non solo per il confronto della neuroplasticità morfologica di diverse sezioni in varie condizioni di trattamento, ma anche per confronti tra parametri all'interno della stessa area. Ricorda di pianificare e preparare a fondo prima di iniziare la trasduzione in utero e di essere sicuro di avere il backup di materiali e strumenti in caso di complicazioni. Seguendo il nostro metodo, è possibile aggiungere altre tecniche come l'etichettatura immunogold prima della microscopia elettronica per il tracciamento ultrastrutturale di una molecola di interesse definita.
Partendo da una visione olistica dell'intero organismo e zoomando verso la topografia molecolare, siamo in grado di studiare e manipolare la relazione tra funzione tissutale e morfologia. Il tetrossido di osmio è pericoloso. Assicurati di lavorare sempre sotto il cofano e di indossare occhiali protettivi e guanti quando lavori con questo reagente.
